朱忠華 唐麗琴 張世能

1.黃山市人民醫(yī)院藥劑科，安徽 黃山 245000 2.中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥 230000 3.黃山學院教務處，安徽 黃山 245000

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是以低骨量、骨微結構退化，骨強度降低、骨脆性及骨折危險性增加為特征的一種全身性骨骼疾病[1]。OP的發(fā)生是骨形成和骨吸收的骨重建進程失衡，涉及調控成骨細胞和破骨細胞平衡失調的一系列細胞因子和信號分子的影響[2]。Wnt/β-catenin信號通路在骨形成和骨代謝過程中發(fā)揮關鍵性作用，經典Wnt信號通路激活，可誘導成骨細胞的增殖和分化，增強成骨細胞礦化活性，增加骨密度和骨強度，同時抑制成骨細胞凋亡，另外間接影響破骨細胞功能，影響骨吸收[3-4]。因此，本研究通過觀察雙膦酸鹽類聯合他汀類藥物對骨質疏松大鼠骨組織Wnt/β-catenin信號通路相關因子的影響，進一步揭示雙膦酸鹽和他汀類藥物防治OP的相關分子生物學機制，以期為OP防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

阿侖膦酸鈉片(福善美)(70 mg/片，生產批號：J20190085)和辛伐他汀片(舒降之)(20 mg/片，生產批號：J20190621)均購于美國默沙東制藥有限公司，Wnt、β-catenin、Runx-2多克隆抗體購于美國R&D公司。PCR試劑盒購于英國Abcam公司，雙能X線骨密度儀購于美國Norland公司，骨生物力學實驗儀購于日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1實驗動物與分組：65只3月齡，體重(350±30) g，雌性SD大鼠，購于安徽醫(yī)科大學動物實驗中心，將大鼠予以國家標準(溫度：20 ℃～25 ℃，濕度：60%～70%，12 h間隔正常照明)分籠飼養(yǎng)，自由飲食攝水。按數字表完全隨機化分組：對照組、模型組、A藥組(阿侖膦酸鈉組)、B藥組(辛伐他汀組)、A+B藥組(阿侖膦酸鈉聯合辛伐他汀組)。對照組不作任何處理，其余4組大鼠均行骨質疏松模型。

1.2.2大鼠骨質疏松造模與藥物處理：參考文獻[5]采用雙側卵巢切除術方法構造骨質疏松大鼠動物模型。術后第3天均采用灌胃方式給藥，對照組和模型組：(同等量0.9% Nacl)，A藥組：[(福善美 0.5 mg/(kg·d)]，B藥組：[舒降之 4 mg/(kg·d)]，A+B藥組：[福善美 0.5 mg/(kg·d)，舒降之 4 mg/(kg·d)]，連續(xù)用藥8周。

1.2.3取材及標本處理：采用快速心臟急性大失血法處死大鼠，取血約6～8 mL，離心，3 000 r/min×15 min，收集上層血清1～2 mL，-20 ℃保存?zhèn)溆?。逐層剝離腰椎及股骨，以0.9%Nacl濕紗布包裹待BMD檢測，測定完畢后迅速轉入液氮，用于RT-PCR和Western blot檢測。另留取脛骨10%甲醛溶液固定，10% EDTA 脫鈣6周，制作石蠟切片，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4骨組織骨密度(BMD)測定：取出待測腰椎和股骨，采用DPX-L型雙能X線骨密度掃描儀，采用小物體掃描模式(類型：hHi-Res、精度：1%、速度：50 mm/s、寬度：5.0 cm、分辨率：1.0 mm×1.0 mm)等參數值，選定興趣區(qū)連續(xù)檢測5次，求其均值，軟件分析計算BMD值。

1.2.5骨組織骨生物力學指標測定：將骨組織置于電子萬能生物力學萬能材料試驗機，固定骨標本位置，均取同一體位，保持標本上下面水平，壓點處于骨中間位置的正上方，自上往下加載下壓直至骨斷裂，(跨距：24 mm，速度：2 mm/min，量程：1 000 N)，記錄儀記錄載荷-變形曲線。

1.2.6實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測骨組織Wnt、β-catenin和Runx2的mRNA表達：取股骨組織30 mg，參照PCR試劑盒說明書逐步操作，Trizol法提取總RNA，依據Prime ScriptTM reagent逆轉錄試劑盒以獲得cDNA，PCR熱循環(huán)儀擴增。擴增條件：93 ℃預變性5 min；95 ℃變性2 min，75 ℃退火40 s，60 ℃延伸60 s，共45循環(huán)。β-catenin為內參照基因，采用2-ΔΔCt法計算各基因相對表達量?；蛞镄蛄幸姳?。

1.2.7Western blot檢測骨組織Wnt、β-catenin和Runx2蛋白表達：取出股骨組織20 mg，添加液氮研磨，添加細胞裂解液，提取總蛋白，以GAPDH為內參，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，參照Western blot檢測步驟進行操作，對目的條帶進行掃描分析。

1.2.8HE染色觀察骨組織形態(tài)學：參照HE染色法逐步操作，蘇木精染色5 min，鹽酸酒精堿化10 s，伊紅染液染色1～2 min，光鏡下觀察并采集圖片。

表1 qRT-PCR擴增引物序列Table 1 qRT-PCR amplification primer sequences

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組骨組織BMD

模型組較對照組BMD(腰椎、股骨)均顯著降低(P<0.05)，A藥組、B藥組和A+B藥組較模型組BMD(腰椎、股骨)均顯著增高(P<0.05)，以A+B藥組最高，見表2。

表2 各組大鼠骨組織Table 2 BMD of bone tissue in each group

2.2 各組骨組織生物力學

模型組較對照組最大載荷和最大應力(腰椎、股骨)均顯著降低(P<0.05)，A藥組、B藥組和A+B藥組較模型組最大載荷和最大應力(腰椎、股骨)均顯著增高(P<0.05)，以A+B藥組最高。見表3。

表3 各組大鼠骨組織生物力學指標比較Table 3 The biomechanical indexes of bone tissue in each group

2.3 各組骨組織Wnt、β-catenin和Runx2 mRNA表達

模型組較對照組骨組織Wnt、β-catenin和Runx2 mRNA均顯著降低(P<0.05)，A藥組、B藥組和A+B藥組較模型組骨組織mRNA均顯著增高(P<0.05)，以A+B藥組最高。見表4。

表4 各組大鼠骨組織Wnt、β-catenin和Runx2 mRNA比較

2.4 各組骨組織Wnt、β-catenin和Runx2蛋白表達

模型組較對照組骨組織Wnt、β-catenin和Runx2蛋白均顯著降低(P<0.05)，A藥組、B藥組和A+B藥組較模型組骨組織蛋白均顯著增高(P<0.05)，以A+B藥組最高。見圖1和表5。

圖1 Western blot檢測各組骨組織Wnt、β-catenin和Runx2蛋白表達Fig.1 Western blotting analysis of Wnt, β-catenin, and Runx2 protein expression in bone tissue of each group

表5 各組大鼠骨組織Wnt、β-catenin和Runx2蛋白比較

2.5 骨組織形態(tài)學

對照組脛骨骨小梁形態(tài)結構完整，粗壯飽滿、豐富均勻致密，排列緊密規(guī)整，小梁間連接呈網狀，骨髓腔較小，骨髓細胞數量豐富。模型組骨小梁形態(tài)結構差，數量明顯減少，細薄，排列紊亂，部分出現斷裂現象，骨髓腔明顯變大。A藥組、B藥組和A+B藥組骨小梁結構較前完整，數量增多，粗壯飽滿，排列尚規(guī)則，連續(xù)完整性較好，骨小梁間隙略有增大，且A+B藥組骨小梁結構較雙膦酸鹽組和他汀組明顯改善。見圖2。

圖2 HE染色觀察脛骨骨組織的形態(tài)結構(×200)A：對照組；B：模型組；C：A藥組；D：B藥組；E：A+B藥組Fig.2 Observation of morphological structure of the tibia with HE staining (×200)A: Control group; B: Model group; C: Drug group A; D: Drug group; E: Drug group A+B

3 討論

成骨細胞和破骨細胞共同作用影響著骨骼生長、發(fā)育和代謝等一系列過程，成骨細胞和破骨細胞相互耦聯、相互作用形成骨吸收和骨形成之間的平衡，影響骨骼持續(xù)重建過程，維持骨骼的平衡性和完整性[6]。OP由成骨細胞骨形成作用和破骨細胞骨吸收作用之間的動態(tài)平衡被破壞，骨形成緩慢，骨吸收增強，骨吸收強于骨形成，而引起骨重建失衡[7-8]。眾多細胞因子調控的信號通路，通過調控骨形成或骨吸收過程信號通路中的相關因子，以改善骨重建失衡狀態(tài)[9]。經典Wnt/β-catenin信號通路通過直接影響成骨細胞增殖、分化和凋亡，間接影響破骨細胞功能，在骨形成與骨吸收等骨重建方面起著十分重要作用，是當前骨質疏松性疾病的研究熱點。

阿侖膦酸鈉是首個獲得FDA批準用于治療OP的第3代雙膦酸鹽類骨吸收抑制劑藥物[10]。他汀類藥物屬3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A抑制劑[11]。辛伐他汀通過促進Wnt蛋白與其受體Frz及輔助受體LRP5/6結合形成復合物，活化Fz受體，抑制胞質β-catenin的降解，β-catenin累積并進入細胞核與核內轉錄因子TCF/LEF結合，而激活下游相關靶基因Runx2、Osx、c-myc等因子的轉錄和表達[12-13]。以促進成骨細胞增殖和活化，并調節(jié)BMSC向成骨細胞分化，同時抑制成骨細胞凋亡，促進骨形成，抑制骨吸收，維持骨重建過程，從而發(fā)揮抗OP作用[14]。

本研究結果表明阿侖膦酸鈉聯合辛伐他汀藥物組較模型組骨組織BMD、最大載荷和最大應力均顯著升高；阿侖膦酸鈉聯合辛伐他汀藥物組較模型組骨組織Wnt、β-catenin、Runx2 mRNA和蛋白表達均顯著升高。阿侖膦酸鈉聯合辛伐他汀藥物組骨小梁結構完整，數量增多，排列規(guī)則。表明阿侖膦酸鈉聯合辛伐他汀能具有協(xié)同通過激活經典Wnt/β-catenin信號通路增加去勢大鼠的Runx2的表達，促進成骨細胞的增殖和分化，能夠改善骨代謝，從而達到防治OP目的，Wnt/β-catenin信號通路是兩類藥物防治OP主要作用機制。同樣，張磊等[15]研究發(fā)現辛伐他汀通過促進Wnt/β-catenin信號通路相關因子，促進BMSCs向成骨細胞分化。梁耀中等[16]研究表明阿伐他汀通過上調Wnt/β-catenin表達，促進骨質疏松大鼠骨整合。同時諸多研究[17-18]表明阿侖膦酸鈉、辛伐他汀兩藥聯合可改善骨質疏松骨代謝生化指標，增加骨密度，具有協(xié)同抗骨質疏松作用。

綜上所述，本研究初步認為雙膦酸鹽和他汀類藥物可能通過調控經典Wnt/β-catenin信號通路，激活該通路相關因子的表達，增加去勢骨質疏松大鼠骨密度，提高骨生物力學性能，改善骨組織結構，從而發(fā)揮對OP防治作用。但兩類藥物調控Wnt/β-catenin經典信號途徑的具體詳細作用機制還有待深入研究，相信隨著Wnt/β-catenin信號途徑作用機制的逐漸闡明，也將推動此類藥物防治OP研究進展，為防治OP提供新思路和新方法。