張芳，任毅，曹俊梅，李法計，夏先春，耿洪偉?

1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，烏魯木齊 830052；2新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所,烏魯木齊 830091；3山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/小麥玉米國家工程實驗室/農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，濟(jì)南 250100；4中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/國家小麥改良中心，北京 100081

0 引言

【研究意義】小麥（TriticumaestivumL.）是全球播種面積最廣的糧食作物之一，也是中國重要的糧食作物之一，在糧食安全中具有舉足輕重的地位[1]。目前，小麥的需求增長速度逐漸快于產(chǎn)量的提高速度，使得糧食安全面臨嚴(yán)峻考驗。為此，在耕地面積有限的現(xiàn)狀下，提高小麥單產(chǎn)至關(guān)重要[2]。小麥籽粒大小決定粒重高低，其中籽粒的長、寬、面積、周長、長寬比等參數(shù)是構(gòu)成小麥產(chǎn)量的重要指標(biāo)[3]。基于此，研究小麥籽粒性狀的遺傳特性對提高小麥產(chǎn)量及品質(zhì)至關(guān)重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】高產(chǎn)一直是育種家最為關(guān)注的育種目標(biāo)之一，而籽粒性狀的遺傳改良對產(chǎn)量潛力的提升具有顯著影響[4-6]。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，關(guān)聯(lián)分析被應(yīng)用于數(shù)量性狀的遺傳研究，作為基因發(fā)掘的重要手段，為分子標(biāo)記輔助選擇提供了重要依據(jù)[7]。SNP標(biāo)記具有遺傳穩(wěn)定性高、位點豐富且分布廣等特點，其密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的分子標(biāo)記，對于數(shù)量性狀定位更為高效和便捷[8-10]。目前，小麥相繼開發(fā)出9K、90K、660K、15K和50K等滿足不同育種需求的SNP芯片[11-13]。小麥籽粒性狀遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜，受微效多基因控制，國內(nèi)外已有大量學(xué)者對小麥籽粒相關(guān)性狀進(jìn)行了遺傳研究，并對調(diào)控小麥籽粒大小性狀的QTL區(qū)段進(jìn)行了定位和遺傳解析。小麥籽粒性狀已挖掘到QTL位點主要位于1A、1B、1D、2A、2B、2D、3B、4B、5A、6B、7B和7D等染色體[14-16]。LI等[17]利用 W7984×Opata85重組自交系進(jìn)行連鎖分析，在2個環(huán)境下均發(fā)現(xiàn)7D染色上控制粒長的主效 QTL，可解釋 13.5%—13.9%的表型變異。全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）作為分析復(fù)雜性狀遺傳結(jié)構(gòu)的有力工具，在水稻、玉米和擬南芥中得到了廣泛的應(yīng)用[18-21]。BHATTA等[22]以143份面包小麥品種為材料，采用GWAS關(guān)聯(lián)分析，在1B、1D、2A、2B、3A、3B、4A、4B、4D、5A、5B、5D、6D、7A、7B染色體上共檢測到 38個籽粒性狀相關(guān)位點，其貢獻(xiàn)率為0.3%—19.6%。SUN等[23]利用90K SNP芯片對163份小麥主載品種（系）進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，在1A、3A、3D、5B、5D、6A、6B和7A染色體上檢測到多個千粒重相關(guān)位點，貢獻(xiàn)率為15.7%—31.6%。DABA等[24]利用200份冬小麥群體在2個環(huán)境下對粒重和粒長進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，檢測到26個粒重和27個粒長顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記。LI等[25]采用SNP-GWAS方法對166份黃淮麥區(qū)小麥品種進(jìn)行產(chǎn)量相關(guān)性狀分析，分別挖掘出 20個粒長和 31個粒寬顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，貢獻(xiàn)率分別為7.1%—14.2%和6.8%—15.0%，其中位于 2A染色體的IWB32119標(biāo)記與粒重基因TaFlo2-A1[26]的位點一致?！颈狙芯壳腥朦c】新疆作為中國主要的小麥產(chǎn)區(qū)之一，對產(chǎn)量的提升至關(guān)重要。然而，該地區(qū)小麥生長關(guān)鍵階段常面臨干旱少雨和干熱風(fēng)等不利環(huán)境的影響，常規(guī)育種手段依舊有效，但靠其進(jìn)行單產(chǎn)的提升，跟不上生產(chǎn)需求，需對分子標(biāo)記等新技術(shù)進(jìn)行充分使用，但基于高密度芯片技術(shù)對新疆小麥籽粒性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析鮮有報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以121份新疆種植的小麥品種（系）為材料，結(jié)合50K SNP芯片對千粒重、粒長、粒寬、籽粒長寬比、籽粒面積和籽粒周長等6個籽粒性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，以期獲得新的與籽粒性狀關(guān)聯(lián)的SNP位點，為小麥聚合育種及復(fù)雜數(shù)量性狀位點的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及田間種植

選用121份新疆種植小麥品種（系），其中引進(jìn)品種（系）36份，分別來自前蘇聯(lián)、烏克蘭、羅馬尼亞、北京和河北；自育品種（系）68份；地方品種（系）17份。上述材料由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥遺傳育種課題組提供。

參試材料于 2016—2017、2017—2018和 2018—2019年度種植于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院瑪納斯農(nóng)業(yè)試驗站，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，三行區(qū)，行長2 m，行距25 cm，3次重復(fù)。田間管理遵循當(dāng)?shù)鼗驹耘喙芾矸绞?。待小麥生理成熟期后，按每品種取10株收獲脫粒，在自然曬干后均通過杭州萬深 SC-G拷種儀器檢測千粒重（thousand kernel weight，TKW）、粒長（grain Length，GL）、粒寬（grain width，GW）、粒長寬比（length width ratio，LWR）、籽粒面積（grain area，GA）、籽粒周長（grain perimeter，GC）。利用 IciMapping的ANOVA功能進(jìn)行田間數(shù)據(jù)分析及遺傳力的估算。廣義遺傳力（h2），計算公式：h2=σg2/（σg2+σe2），σg2為遺傳方差，σe2為環(huán)境方差。

1.2 SNP標(biāo)記檢測

50K標(biāo)記利用Illumina SNP Genotyping技術(shù)測試平臺（北京博奧生物有限公司），使用微珠芯片技術(shù)（Bead Array）進(jìn)行檢測，利用Genomestudio v1.0軟件進(jìn)行多態(tài)性分析。獲得的基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，刪除缺失率＞20%的標(biāo)記，過濾掉最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＜5%的標(biāo)記。

1.3 群體結(jié)構(gòu)分析

采用PowerMarker V3.25軟件對參試材料進(jìn)行遺傳多樣性和多態(tài)性信息含量分析。其中，PIC=1-∑(Pij)2，Pij表示i位點的第j個等位變異出現(xiàn)的頻率。

選取在小麥21條染色體上均勻分布的2 000個SNP標(biāo)記，利用Structure 2.3.4軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。參數(shù)設(shè)置：Burn-in period為10 000，MCMC為100 000，選擇Admixed模型，設(shè)K=2—12，每個K重復(fù)5次，結(jié)果上傳Structure Harvester，獲得最佳K值作為亞群數(shù)目。

1.4 關(guān)聯(lián)分析

應(yīng)用Tassel V5.0中的混合線性模型（mixed linear model，MLM）對SNP標(biāo)記與性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，并利用Structure 2.3.4軟件計算Q值，結(jié)合Tassel V5.0軟件計算Kinship值。在P＜0.001水平下認(rèn)為標(biāo)記與性狀存在關(guān)聯(lián)，以第95百分位的r2值作為閾值估測LD衰減距離。

2 結(jié)果

2.1 表型分析

通過對千粒重、粒長、粒寬、籽粒長寬比、籽粒面積和籽粒周長等6個籽粒相關(guān)性狀的表型進(jìn)行統(tǒng)計分析（表 1），結(jié)果表明，不同環(huán)境間各性狀均表現(xiàn)較大差異，其中，千粒重變異系數(shù)最大。各指標(biāo)的峰度和偏度均接近1，說明均符合正態(tài)分布，是多基因控制的數(shù)量性狀。方差分析（表2）表明，各性狀在基因型、環(huán)境及基因型與環(huán)境互作間均呈現(xiàn)出極顯著差異（P＜0.001）。6個籽粒相關(guān)性狀的廣義遺傳力（h2）為0.85—0.90，其中，長寬比和粒寬的遺傳力較高，分別達(dá)到0.90和0.89，表明小麥籽粒性狀主要受遺傳變異影響。相關(guān)性分析（表3）表明，粒長與籽粒周長相關(guān)性最大（r=0.94），其次為粒寬與千粒重相關(guān)性最好（r=0.93）；長寬比與千粒重、粒寬和籽粒面積呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.001），進(jìn)一步說明小麥籽粒性狀間存在協(xié)同變化關(guān)系。

表1 小麥自然群體籽粒性狀基本統(tǒng)計信息Table 1 Phenotypic data analysis of grain size related traits in the wheat nature population

表2 小麥籽粒性狀方差分析Table 2 Analysis of variance of grain size related traits in the wheat

表3 小麥籽粒性狀間相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of grain size related traits in the wheat

2.2 標(biāo)記遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)

利用50K SNP芯片對121份新疆種植的小麥品種（系）進(jìn)行檢測，經(jīng)過質(zhì)量控制最終篩選出36 873個SNP標(biāo)記進(jìn)行GWAS分析，其中，A基因組、B基因組和D基因組染色體平均包含16 514、11 490和8 869個SNP標(biāo)記，每個標(biāo)記間的平均距離為0.39 Mb（電子附表1）。A與B基因組的染色體組所用標(biāo)記密度、標(biāo)記數(shù)目、遺傳多樣性和多態(tài)信息含量均高于D染色體組。SNP標(biāo)記的PIC值為0.09—0.38，平均值為0.32。

利用Structure 2.3.4軟件分析，獲得121份新疆種植的小麥自然群體結(jié)構(gòu)Q值與極大似然值LnP（D），進(jìn)一步確定最佳K值。當(dāng)K=4時（圖1-A），ΔK值最大，由圖1-B可知，參試材料被劃分為4個亞群（subpopulation），其中，亞群Ⅰ（SubgroupⅠ）包含46份品種（系），主要來自自育和引進(jìn)品種（系），分別占比47.83%和41.30%，引進(jìn)品種多為前蘇聯(lián)品種（系）；亞群Ⅱ（SubgroupⅡ）包含29份品種（系），主要來自自育品種（系），占比79.31%；亞群Ⅲ（SubgroupⅢ）包含41份品種（系），包含56.10%的自育品種（系）、26.83%的引進(jìn)品種（系）和17.07%的地方品種（系）；亞群Ⅳ（SubgroupⅣ）包含5份品種（系），均來自地方品種（系）；4個亞群所含品種數(shù)分別占總材料份數(shù)的38.02%、23.97%、33.88%和4.13%。

2.3 籽粒相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)分析

基于 LD衰減距離計算，將在物理圖譜上前后 3 Mb區(qū)間內(nèi)的位點認(rèn)定為一個候選位點。用36 873個分子標(biāo)記對3個環(huán)境及平均環(huán)境下的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析（圖2），6個小麥籽粒相關(guān)性狀共檢測到592個顯著SNP位點（P＜0.001），單個關(guān)聯(lián)標(biāo)記位點解釋的表型變異（R2）范圍為9.3%—28.6%。其中29個SNP至少在2個環(huán)境中被檢測到，分布在1A（5）、1B（2）、1D、2A（5）、3B、5A、5D、6B（4）、6D、7B和 7D（7）染色體上，可解釋 9.3%—22.7%的表型變異（表4）。檢測到6個與千粒重穩(wěn)定關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，分布在1B、2A和6B染色體上，其中在6B染色體檢測到 4個千粒重位點（AX-109874065、AX-110446017、AX-110936500和AX-109493716），且效應(yīng)值較大，介于9.7%—12.9%，說明 6B染色體對千粒重影響較大，可作為籽粒性狀重要的染色體。檢測到6個與粒長穩(wěn)定關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，分布在1A、2A和7D染色體上，其中AX-111082947和AX-94497666在3個環(huán)境和均值下同時被檢測到，表型變異解釋范圍為9.9%—22.7%。檢測到2個與粒寬穩(wěn)定關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，分布在 3B和 5D染色體上的AX-108948870與AX-179477405，表型變異解釋范圍為9.6%—12.2%。檢測到6個與長寬比穩(wěn)定關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，分布在2A（2）、5A、7B和7D（2）染色體上，其中位于2A染色體的AX-111722425標(biāo)記在全部環(huán)境下均被重復(fù)檢測到，可解釋10.1%—18.3%表型變異。檢測到3個與籽粒面積穩(wěn)定關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，分布在1A、1B和1D染色體上，表型變異解釋率范圍為9.9%—18.2%，表明1號同源群對籽粒面積具有重要作用。檢測到6個與籽粒周長穩(wěn)定關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，分布在1A（2）、2A、6D和7D（2）染色體上，其中，位于1A染色體的AX-111082947標(biāo)記在多環(huán)境下同時被檢測到，且貢獻(xiàn)率最大，可解釋10.1%—22.6%表型變異。

表4 SNP-GWAS檢測到的產(chǎn)量性狀相關(guān)位點Table 4 Loci for grain size related traits in the diversity panel identified by SNP-GWAS

29個穩(wěn)定關(guān)聯(lián)的位點中，位于 1A染色體上的AX-111082947和位于2A染色體上的AX-94497666標(biāo)記均與粒長和籽粒周長顯著關(guān)聯(lián)，貢獻(xiàn)率分別為9.3%—22.7%和 9.3%—11.8%；位于 2A染色體上的AX-111531320標(biāo)記均與千粒重和籽粒長寬比顯著關(guān)聯(lián)，貢獻(xiàn)率分別為 10.3%—17.1%；位于 7D染色體上的AX-111614568標(biāo)記同時與粒長、籽粒周長和籽粒長寬比顯著關(guān)聯(lián)，貢獻(xiàn)率為10.9%—17.3%；位于7D染色體上的標(biāo)記AX-111197303同時與粒長和籽粒周長顯著關(guān)聯(lián)，貢獻(xiàn)率為10.0%—12.6%，說明這5個位點是一因多效位點。

3 討論

3.1 小麥籽粒性狀表型

小麥籽粒性狀包括粒長、粒寬、長寬比、粒厚、籽粒面積、籽粒周長和千粒重等指標(biāo)，其高低是衡量產(chǎn)量的重要依據(jù)之一，且性狀便于觀察，作為小麥育種選擇最直觀的性狀，往往受到研究者的高度關(guān)注[34]。DHOLAKIA 等[35]認(rèn)為小麥籽粒性狀不但對產(chǎn)量具有影響，也決定小麥的商品價值。粒重受粒長、粒寬、粒厚以及籽粒周長等方面的直接影響[36]，其中粒寬與粒重呈顯著正相關(guān)，相關(guān)性較大。陳佳慧等[37]、余曼麗等[38]發(fā)現(xiàn)千粒重與粒長、粒寬、籽粒面積、籽粒周長均呈極顯著正相關(guān)，與籽粒長寬比呈負(fù)相關(guān)，這與本研究結(jié)果基本一致。此外發(fā)現(xiàn)粒長與籽粒周長、粒寬與籽粒面積存在協(xié)同促進(jìn)關(guān)系，說明各性狀在生長發(fā)育過程中由單個基因多效性引起或多個基因緊密連鎖共同控制某些性狀來作為性狀相關(guān)的遺傳基礎(chǔ)。不同類型新疆種植的小麥材料中，自育品種的大粒表現(xiàn)較高，地方品種次之，引進(jìn)品種較低，這一結(jié)果與馬艷明等[39]基本一致，充分體現(xiàn)了新疆自育品種間籽粒性狀差異較豐富。究其原因一方面是自育品種經(jīng)過育種家多年以大粒選擇為主有關(guān)，其重視度和選擇度較強(qiáng)；另一方面是結(jié)合當(dāng)?shù)丨h(huán)境的育種需求，大粒小麥品種對小麥粒重遺傳改良具有較大的提升空間，將更有利于中國小麥高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新品種培育。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)籽粒長寬比地方品種顯著高于自育品種和引進(jìn)品種，這可能由于地方品種一般為長而尖粒型，其粒長較粒寬發(fā)育較早，而育成品種在選育過程中，著重于粒長粒寬進(jìn)行改良，呈現(xiàn)出粒寬的增加同時粒長未發(fā)生明顯變化[39]。這一結(jié)果充分體現(xiàn)出千粒重提高主要由粒寬的增加而影響，而小麥產(chǎn)量的提升主要由千粒重來貢獻(xiàn)。

3.2 小麥籽粒性狀GWAS分析

在多個環(huán)境下均能被檢測到的關(guān)聯(lián)位點可視為相對穩(wěn)定的位點，本研究共檢測到29個籽粒性狀穩(wěn)定關(guān)聯(lián)的SNP位點。粒長穩(wěn)定位點分布于1A、2A和7D染色體上，LI等[25]通過166份黃淮麥區(qū)材料結(jié)合90K SNP芯片進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，在2A染色體上發(fā)現(xiàn)一個穩(wěn)定位點，并確定為粒重基因TaFlo2-A1的位點，這與本研究在2A染色體檢測到的標(biāo)記AX-94497666所在位點相距僅約3.4 Mb，可能為相同位點，該位點控制的粒長效應(yīng)可能來自于該基因的作用。同時位于 7D染色體上的標(biāo)記AX-111614568檢測到一個粒長相關(guān)位點，這與粒重基因TaGS-D1位點一致，也為相同位點[29]。粒長標(biāo)記AX-95633409與 DABA等[24]發(fā)現(xiàn)位點QKLpur-7D.1較近，相距0.5 Mb，LI等[30]與MIR等[31]分別也在7D染色體上檢測到標(biāo)記QKL.caas-7DS和QGw.ccsu-7D.1與本研究粒長標(biāo)記AX-111197303均位于短臂區(qū)域。本研究在 3B染色體上發(fā)現(xiàn)的控制粒寬的SNP標(biāo)記AX-108948870與王瑞霞等[27]、SUN等[23]報道的粒寬QTL位置相似，其表型貢獻(xiàn)率較大，CABRAL等[40]也證實了在3B染色體上相近的位置上發(fā)現(xiàn)了一個QTL位點。位于7B染色體上發(fā)現(xiàn)籽粒長寬比標(biāo)記AX-112286258貢獻(xiàn)率最大，KUMARI等[32]檢測到的 QTL位點相距 31.6 Mb。XIN 等[33]利用Dalibao×BYL8 RIL進(jìn)行籽粒性狀 QTL定位，獲得qKA1B-1籽粒面積位點與本研究發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記AX-179476290位置相近。對于千粒重，在6B染色體上鑒定了 4個穩(wěn)定顯著 SNP標(biāo)記（AX-109874065、AX-110446017、AX-110936500和AX-109493716），其貢獻(xiàn)率為9.7%—12.9%。其中，AX-109874065標(biāo)記與張坤普[28]報告的千粒重的位點TKW-xgwm533僅為1.3 Mb，因此，筆者認(rèn)為上述屬于同一位點控制千粒重高低。DABA等[24]和LI等[25]分別檢測到QKWpur-6B和AX_110368497與本研究標(biāo)記AX-110446017相距31.7和31.9 Mb，說明該染色體上存在粒重密切相關(guān)位點。MUHAMMAD等[41]也在6B染色體檢測到控制千粒重的位點，其貢獻(xiàn)率為12.0%—14.0%，后期將對該染色體的重要位點進(jìn)行SNP標(biāo)記開發(fā)，為分子標(biāo)記輔助選擇提供有效的選擇標(biāo)記。

本研究在位于1A、1B、2A、5A、5D、6B和7D染色體上發(fā)現(xiàn)可能與籽粒相關(guān)性狀穩(wěn)定遺傳的新位點。其中，在 2A染色體上發(fā)現(xiàn)控制千粒重的新位點SNP標(biāo)記AX-111531320，同時也控制籽粒長寬比，其效應(yīng)值大于10%且穩(wěn)定。共位點區(qū)域可能存在著控制不同性狀的多個基因，或者是存在一個基因控制多個性狀[42]。位于1A染色體上標(biāo)記AX-111082947被發(fā)現(xiàn)是新位點且貢獻(xiàn)率最大，為9.8%—22.7%，同時影響粒長和籽粒周長，有可能為控制小麥粒重主效位點，該基因可在小麥產(chǎn)量育種中起到重要的作用，可優(yōu)選1A染色體關(guān)聯(lián)位點進(jìn)行功能標(biāo)記開發(fā)，為分子標(biāo)記輔助育種提供有效信息。在 7D染色體上接觸到的位點AX-111197303標(biāo)記，也可同時影響粒長和籽粒周長，表明這兩個位點控制粒長和籽粒周長的基因可能為同一基因且驗證了粒長與籽粒周長具有協(xié)同作用。后期研究可聚焦這些多效應(yīng)位點且在多環(huán)境下均被檢測到的穩(wěn)定位點，進(jìn)一步開展精細(xì)定位和分子標(biāo)記開發(fā)等研究。

4 結(jié)論

本研究材料遺傳多樣性豐富，在2個及以上環(huán)境中共檢測到29個與6個籽粒性狀穩(wěn)定顯著關(guān)聯(lián)位點，其中標(biāo)記AX-94497666和AX-111614568與粒長和籽粒周長顯著關(guān)聯(lián)，與前人發(fā)現(xiàn)的TaFlo2-A1和TaGS-D1相吻合。檢測到5個顯著位點為多效性位點，貢獻(xiàn)率為9.9%—22.7%。標(biāo)記AX-111082947（1A）和AX-111197303（7D）與粒長和籽粒周長顯著關(guān)聯(lián)，貢獻(xiàn)率分別為9.8%—22.7%和10.0%—12.6%。