付 媛，石團(tuán)員，孫洪超

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021)

嗜血支原體(Hemotropicmycoplasma，HM)，又稱(chēng)附紅細(xì)胞體，是一類(lèi)感染多種哺乳動(dòng)物，寄生于紅細(xì)胞表面及骨髓中的支原體[1]。HM破壞紅細(xì)胞導(dǎo)致宿主發(fā)生溶血性、傳染性貧血，可導(dǎo)致母豬流產(chǎn)死胎、仔豬貧血、黃疸和消瘦[2-3]。我國(guó)豬群中流行三種HM，早期鑒定的豬支原體(Mycoplasmasuis，M.suis豬附紅細(xì)胞體)、2011年分子生物學(xué)水平鑒別的微小支原體(M.parvum)和2017年報(bào)道的新種CandidateMycoplasmahemosuis(CMh)[4-6]。

PCR方法病原流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)M.parvum在我國(guó)浙江和海南有較高的流行率，兩種或三種豬源HM混合感染多有發(fā)生，母豬感染率較高[6-7]，目前僅有M.suis血清抗體檢測(cè)方法的報(bào)道[8-9]，缺少M(fèi).parvum和CMh的抗體檢測(cè)方法。甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH)是糖酵解途徑中重要的酶類(lèi)和看家基因，同時(shí)具有參與細(xì)胞內(nèi)消化、tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、DNA修復(fù)和復(fù)制、細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)功能[10]。研究表明，M.suis的GAPDH(以前稱(chēng)作MSG1)也同樣有重要的生理功能，作為和紅細(xì)胞膜黏附相關(guān)的黏附因子對(duì)于豬附紅體的生物化學(xué)反應(yīng)和生理功能有重要的意義，也是致病相關(guān)因子，同時(shí)該蛋白具有良好的免疫原性，可用于血清學(xué)診斷[11]。我們已克隆到M.parvumZJ9330株GAPDH基因序列mp-gapA[12]。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究擬建立M.parvum血清抗體 ELISA方法，用于檢測(cè)豬群M.parvum抗體水平和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，為該病的控制提供基本資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體和血清

大腸埃希菌Transetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，由248份血液采自浙江省紹興上虞、杭州蕭山等6個(gè)豬場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)室分離血清-20 ℃保存?zhèn)溆?。M.parvum51份陰性血清為進(jìn)口種豬血清，由浙江省出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心惠贈(zèng)，經(jīng)PCR檢測(cè)病原陰性。M.parvum陽(yáng)性血清為PCR方法鑒定陽(yáng)性母豬采集血清，小鼠抗mp-tGAPDH血清由本試驗(yàn)室制備保存。M.parvumDNA模板、pET28載體、M.suis和CMh陽(yáng)性血清、豬弓形蟲(chóng)病(Toxoplasmagondii，TG)的陽(yáng)性血清均由本試驗(yàn)室保存。豬圓環(huán)病毒病(porcine circovirus，PCV)、豬瘟(classical swine fever virus，CSFV)、偽狂犬病(pseudorabies virus，PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)陽(yáng)性血清均來(lái)自IDEXX 公司相應(yīng)的ELISA檢測(cè)試劑盒。

1.1.2 主要試劑和儀器

過(guò)氧化物酶標(biāo)山羊抗豬IgG購(gòu)自KPL公司；親和層析Ni-NTA Argrose Beads為Invitrogen公司產(chǎn)品，TMB和其他試劑購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；酶標(biāo)儀為美國(guó)Molecular Devices公司Spectra Max M5；蛋白電泳儀為Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原制備

根據(jù)已克隆M.parvum浙江9330株的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因gapA序列信息(序列號(hào)KU246052)[12]，比對(duì)已知的3種豬源HMgapA基因序列分析，選擇差異較大且抗原性好的區(qū)域設(shè)計(jì)引物，序列為mpgnf：5′-ccatggGCAGAAATTTATTAGA-3′;mpgnr：5′-ctcgagAACAATTAAATTATGG-3′，上游引物含有NcoⅠ(ccatgg)酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基，下游引物含有XhoⅠ(ctcgag)酶切位點(diǎn)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增404 bp片段。擴(kuò)增截短蛋白mp-tGAPDH DNA序列，構(gòu)建pET28-mp-tGAPDH質(zhì)粒，在大腸埃希菌Transetta(DE3)優(yōu)化表達(dá)mp-tGAPDH，通過(guò)Ni Argrose純化蛋白，用小鼠抗mp-tGAPDH血清Western-blot檢測(cè)其抗原性。

1.2.2 最佳包被濃度及血清最佳稀釋倍數(shù)的確定

采用方陣滴定的方法，將起始濃度為560 μg·mL-1mp-tGAPDH純化蛋白用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液倍比稀釋包被酶標(biāo)板，每孔100 μL，每個(gè)濃度包被1行，37 ℃溫育1 h后，4 ℃過(guò)夜，取出用PBST洗滌液洗滌3次，每次3 min，每孔加入200 μL 5%脫脂乳封閉液，37 ℃封閉1 h，PBST洗滌；陽(yáng)性血清和陰性血清分別在酶標(biāo)板的前6列及后6列進(jìn)行橫向倍比稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度縱向做8孔重復(fù)，每孔100 μL，37 ℃反應(yīng)1 h后，PBST洗滌；加入1∶10 000羊抗豬IgG-HRP(用封閉液稀釋)，每孔100 μL，37 ℃反應(yīng)30 min；洗滌后加入TMB底物100 μL，室溫反應(yīng)5 min；最后加入50 μL 0.5 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定D值，以陽(yáng)性血清作用孔D450值開(kāi)始出現(xiàn)較大變化，而對(duì)應(yīng)的陰性血清孔D450值基本不變所對(duì)應(yīng)的抗原濃度及血清稀釋倍數(shù)作為抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)。

1.2.3 最佳封閉液和封閉時(shí)間選擇

分別以最適mp-tGAPDH抗原濃度37 ℃1 h，4 ℃過(guò)夜包被酶標(biāo)板，洗滌3次后，用質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為2.5%、5.0%、7.5%的脫脂奶粉，1%、2%、3%BSA等6種不同的封閉液進(jìn)行封閉，每孔150 μL于37 ℃封閉0.5、1.0和1.5 h。分別按照間接ELISA檢測(cè)程序操作，測(cè)定D450，計(jì)算各組陰、陽(yáng)性血清的P/N值，選擇合適的封閉液和封閉時(shí)間。

1.2.4 血清最佳反應(yīng)時(shí)間

按照最佳條件依次包被、封閉和加入血清，37 ℃下反應(yīng)0.5、1.0和1.5 h，重復(fù)2孔。后進(jìn)行ELISA檢測(cè)，測(cè)定D450，計(jì)算各組陰、陽(yáng)性血清的P/N值，以選擇合適的血清最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.5 酶標(biāo)二抗工作濃度和時(shí)間的確定

按照最佳條件依次包被、封閉和加入血清作用后，經(jīng)洗滌加入酶標(biāo)二抗(1∶7 500、1∶10 000、1∶12 500稀釋)，每孔100 μL，重復(fù)2孔，37 ℃下反應(yīng)30、45、60 min，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，測(cè)定D450，計(jì)算各組陰、陽(yáng)性血清的P/N值，以選擇適宜酶標(biāo)二抗工作濃度和時(shí)間。

1.2.6 間接ELISA陽(yáng)性臨界值的確定

1.2.7 特異性試驗(yàn)

用建立優(yōu)化好的mp-tGAPDH間接ELISA方法分別檢測(cè)幾種常見(jiàn)豬病PCV、CSFV、PRV、PRRS、TG的陽(yáng)性血清，酶標(biāo)儀讀取D450值，以此確定ELISA方法檢測(cè)血清的特異性。

1.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

1.2.9 ELISA檢測(cè)豬源嗜血支原體抗體應(yīng)用

用mp-tGAPDH ELISA方法對(duì)浙江上虞地區(qū)5個(gè)不同豬場(chǎng)的248份送檢血清進(jìn)行抗體檢測(cè)，分別統(tǒng)計(jì)M.parvum陰、陽(yáng)性血清份數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原表達(dá)

PCR擴(kuò)增mp-tGAPDH DNA序列連接pET28a載體，將重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定為404 bp，與預(yù)期相符，編碼134個(gè)氨基酸(圖1)。將構(gòu)建好的pET28-mp-tGAPDH表達(dá)的截短蛋白轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Transetta(DE3)后，IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳可以觀察到，mp-tGAPDH在大腸埃希菌Transetta(DE3)中大量表達(dá)，相對(duì)分子質(zhì)量約為15 ku，與預(yù)期相符(圖2)。Western-blot表明，純化蛋白mp-tGAPDH與小鼠抗mp-tGAPDH血清有較好的反應(yīng)性(圖3)。

2.2 最佳包被濃度及血清最佳稀釋倍數(shù)的確定

mp-tGAPDH重組蛋白方陣滴定試驗(yàn)結(jié)果表明，純化抗原在1∶10～1∶160稀釋度時(shí)與陽(yáng)性血清反應(yīng)的D450值變化較小，而在1∶160～1∶1 280稀釋度時(shí)與陽(yáng)性血清反應(yīng)的D450值大幅度下降，因此選定D450值開(kāi)始出現(xiàn)大幅度降低時(shí)的抗原稀釋倍數(shù)1∶160(560/160，3.5 μg·mL-1)包被。抗原在1∶160稀釋時(shí)，1∶160稀釋的陽(yáng)性血清與陰性血清的比值(P/N)最大，此時(shí)陽(yáng)性血清D450值接近于1，陰性血清的D450值基本不變，因此，選擇1∶160為血清最佳稀釋倍數(shù)。

M，DNA marker DL1000；1、2，M. parvum陽(yáng)性血液PCR擴(kuò)增mp-tGAPDH 基因片段；3、4，陰性對(duì)照；M, DNA marker DL1000; 1, 2, PCR product of mp-tGAPDH from M. parvum positive blood sample; 3, 4, Negative control.圖1 mp-tGAPDH基因PCR擴(kuò)增Fig.1 Amplified mp-tGAPDH gene fragment by PCR

M，Protein marker；Lane 1, 2，pET28-mp-tGAPDH在大腸埃希菌Transetta(DE3)表達(dá)目的片段的SDS-PAGE電泳；3，pET28a 在大腸埃希菌Transetta(DE3)表達(dá)目的片段的SDS-PAGE分析。M, Protein marker; Lane 1, 2, pET28-mp-tGAPDH in Transetta(DE3); 3, pET28a in Transetta(DE3).圖2 mp-tGAPDH在大腸埃希菌中的表達(dá)分析Fig.2 SDS PAGE analysis expression of mp-tGAPDH in different E. coli

M，Protein marker；1，純化mp-tGAPDH的SDS-PAGE電泳分析；2，小鼠抗mp-tGAPDH 血清和mp-tGAPDH純化蛋白的Western-blot反應(yīng)，箭頭指示反應(yīng)條帶。M, Protein marker; 1, SDS-PAGE of purified mp-tGAPDH; 2, mp-tGAPDH Western-blot using mouse anti-mp-tGAPDH serum. Reaction band indicated by arrow.圖3 重組蛋白mp-tGAPDH Western-blot分析免疫反應(yīng)性Fig.3 Western-blot analysis immunoreactivity of mp-tGAPDH

2.3 最佳封閉液和封閉時(shí)間選擇

將包被好的ELISA 酶標(biāo)板條分別以 2.5%、5.0%、7.5%脫脂乳，1%，2%、3%BSA進(jìn)行封閉，隨機(jī)選取的6份M.parvum陽(yáng)性血清(P)和6份陰性血清(N)用ELISA方法測(cè)定D450值之比(P/N)。從P/N值可以看出，7.5%脫脂奶粉最佳，其次為5.0%脫脂奶粉，而B(niǎo)SA作為封閉液陰性本底高，不適宜封閉(表1)。

將包被好的ELISA 酶標(biāo)板條分別選用5.0%和7.5%脫脂奶粉封閉0.5、1.0、1.5h后，隨機(jī)選取的6份M.parvum陰、陽(yáng)性血清所測(cè)定的D450值之比(P/N)如表2所示，mp-tGAPDH抗原以5%脫脂奶粉封閉1.5 h結(jié)果最理想。

表1 mp-tGAPDH ELISA最佳封閉液優(yōu)化結(jié)果

表2 mp-tGAPDH ELISA封閉液封閉時(shí)間優(yōu)化結(jié)果

2.4 血清最佳反應(yīng)時(shí)間

在確定的重組抗原最佳包被濃度、血清最佳稀釋倍數(shù)、最佳封閉液濃度、最佳封閉時(shí)間的條件下，隨機(jī)選取的6份M.parvum陰、陽(yáng)性血清作用時(shí)間設(shè)置3個(gè)梯度，所測(cè)定的D450值之比。血清作用0.5、1.0、1.5 h后，從測(cè)定血清的P/N值看，mp-tGAPDH重組抗原ELISA方法待檢血清作用1.0 h效果最佳(表3)。

2.5 酶標(biāo)二抗工作濃度和時(shí)間的確定

采用優(yōu)化好的其他ELISA條件，選用1∶7 500、1∶10 000、1∶12 500稀釋的二抗作用30 min后，測(cè)定隨機(jī)選取的6份M.parvum陽(yáng)(P)、陰(N)性血清D450比值(P/N)。測(cè)定的結(jié)果表明，mp-tGAPDH抗原包被的板以二抗1∶12 500稀釋濃度作用最佳(表4)。

采用優(yōu)化好的其他ELISA條件，選用1∶12 500稀釋的二抗作用30、45、60 min后，測(cè)定隨機(jī)選取的6份M.parvum陽(yáng)、陰性血清的D450P/N值。測(cè)定的結(jié)果以60 min作用時(shí)間最佳(表5)。

2.6 優(yōu)化后的ELISA反應(yīng)條件

表3 mp-tGAPDH ELISA血清作用時(shí)間優(yōu)化結(jié)果

表4 mp-tGAPDH ELISA二抗稀釋倍數(shù)優(yōu)化結(jié)果

表5 mp-tGAPDH ELISA二抗作用時(shí)間優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)優(yōu)化mp-tGAPDH間接ELISA操作步驟如下：mp-tGAPDH抗原按3.5 μg·mL-1(1∶160)稀釋包被，每孔100 μL，于37 ℃溫育1 h后放置于4 ℃過(guò)夜；取出用洗滌液洗滌3次，每次3 min，然后每孔加入150 μL 5%脫脂乳，37 ℃封閉1.5 h，洗滌1次；然后將待檢血清1∶160稀釋后加入酶標(biāo)板，每孔100 μL，于37 ℃反應(yīng)1 h；洗滌3次后，加入1∶12 500羊抗豬IgG-HRP(用封閉液稀釋)，每孔100 μL，37 ℃反應(yīng)1 h；經(jīng)洗滌后加入TMB底物100 μL，室溫反應(yīng)5 min，最后加入50 μL 0.5 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定D值。

2.7 間接ELISA陽(yáng)性臨界值的確定

2.8 特異性試驗(yàn)

用建立的mp-tGAPDH ELISA方法分別檢測(cè)PCV、CSFV、PRV、PRRS、TG的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表6。mp-tGAPDH間接ELISA與檢測(cè)的豬病血清無(wú)交叉反應(yīng)，mp-tGAPDH ELISA可以檢出CMh陽(yáng)性血清，不能檢出M.suis陽(yáng)性血清。

表6 mp-tGAPDH 間接ELISA方法的特異性

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

2.9.1 批內(nèi)重復(fù)

2.9.2 批間重復(fù)

2.10 ELISA檢測(cè)豬源嗜血支原體抗體應(yīng)用

用建立的重組抗原ELISA方法對(duì)浙江省上虞地區(qū)5個(gè)豬場(chǎng)248份臨床送檢血清進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明M.parvum血清陽(yáng)性率為36.69% (91/248)，疑似31份。

表7 mp-tGAPDH間接ELISA同批抗原包被板批內(nèi)變異系數(shù)

表8 mp-tGAPDH間接ELISA不同批抗原包被板批間變異系數(shù)

3 討論

嗜血支原體不能體外培養(yǎng)，相關(guān)研究進(jìn)展緩慢，Hoelzle等[11]證實(shí)M.suis首個(gè)黏附蛋白MSG1具有甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)活性，該蛋白可利用宿主血糖，使宿主血糖濃度急劇下降，重組表達(dá)MSG1定位于大腸埃希菌細(xì)胞表面，且與豬紅細(xì)胞膜相互作用，粘附于紅細(xì)胞表面。同時(shí)該重組蛋白作為疫苗候選分子可以引起豬群明顯的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)[9]，但攻毒保護(hù)試驗(yàn)沒(méi)有效果，用該重組蛋白建立的ELISA方法有較好的特異性，比菌體抗原ELISA更為敏感和有效[13]。這些研究表明，GAPDH蛋白在豬源嗜血支原體中具有研究?jī)r(jià)值和意義。

分析三種豬源嗜血支原體GAPDH氨基酸序列發(fā)現(xiàn)在20～155 aa區(qū)域差異較大，該區(qū)域具有良好的抗原性[12]，所以本研究選擇表達(dá)該段區(qū)域截短GAPDH蛋白，為建立ELISA方法提供診斷抗原，并嘗試鑒別豬源HMs抗體，但由于GAPDH為看家基因，其保守性不容忽視，建立的ELISA檢測(cè)方法不能有效的鑒別診斷豬源嗜血支原體抗體。

ELISA方法具有靈敏、快速、簡(jiǎn)便和易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，本研究首次建立了基于GAPDH截短蛋白mp-tGAPDH的M.parvum抗體檢測(cè)ELISA方法，與檢測(cè)的部分豬病血清無(wú)交叉反應(yīng)，具有良好的特異性和重復(fù)性，該法為M.parvum臨床診斷、流行病學(xué)研究和免疫檢測(cè)提供有效的手段。