黃偉釗，張晶晶，楊 弘，文 靜，梁 毅，傅劍華

（1.中山大學(xué)腫瘤防治中心胸科//華南腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室//廣東省食管癌研究所，廣東廣州 510060；2.中山市人民醫(yī)院心胸外科，廣東中山 528403；3.中山市人民醫(yī)院放療科，廣東中山 528403）

食管癌總體治療效果欠佳的原因之一，是缺乏早期診斷的簡(jiǎn)便有效的方法。近年，有作者試圖引入基因?qū)W和蛋白質(zhì)的標(biāo)志物作為早期診斷和預(yù)后的評(píng)估，但仍然無(wú)法有效應(yīng)用于臨床。代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)新興領(lǐng)域，為識(shí)別有價(jià)值的生物標(biāo)志物提供了一種強(qiáng)有力的、有前途的方法。代謝組學(xué)描述了生物流體或組織中存在的低分子量代謝物的濃度和通量的研究，這些研究提供了有關(guān)生物系統(tǒng)及其當(dāng)前狀態(tài)的詳細(xì)信息［1-3］。本研究的目的主要是通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）技術(shù)比較一組食管鱗癌和健康志愿者的血清代謝譜，尋找食管鱗癌特有的代謝標(biāo)志物，為食管鱗癌的早期診斷提供參考，為下一步研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選擇一組明確診斷的食管鱗癌患者作為實(shí)驗(yàn)組、一組健康志愿者作為對(duì)照組。病例均來(lái)自中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院和中山市人民醫(yī)院（中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院），研究經(jīng)過上述兩家醫(yī)院的倫理委員會(huì)同意，所有入組的患者和志愿者均已簽署知情同意書。實(shí)驗(yàn)組入組標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)組織病理學(xué)明確診斷；②病理類型為鱗狀細(xì)胞癌；③年齡在18～70 歲；④檢查前均未接受過化療、放療等抗腫瘤治療；⑤臨床分期T1-4N1M0/T4N0M0（stage IIIA or IIIB），無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；⑥無(wú)合并其他惡性腫瘤；⑦無(wú)合并其他代謝性疾??；⑧無(wú)合并感染的表現(xiàn)，如發(fā)熱、血象升高等。對(duì)照組入組條件：①年齡在18～70 歲；②無(wú)合并惡性腫瘤或代謝性疾病。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血清的采集 清晨空腹，7：00 am 采周圍靜脈血；用離心管收集血液樣本，37 ℃或者室溫靜置1h 分層；3 000 r/min（r=8 cm）室溫離心10 min，取上清轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中；12 000 r/min（r=8 cm）4 ℃離心10 min，取上清分裝到1.5 mL的離心管，每管0.2 mL。-80 ℃冰箱凍存，干冰冷藏轉(zhuǎn)運(yùn)。

1.2.2 樣品前處理 取200 μL血清加入400 μL甲醇，渦旋混合30 s；-20 ℃靜置2 h；將樣本4 ℃，13 000 r/min（r=8 cm）離心15 min；取上清于EP 管中，真空抽干；加入100 μL 甲醇渦旋30 s 溶解，13 000 r/min（r=8 cm）離心15 min，取上清過0.22 μm 濾頭過濾，每個(gè)樣品取20 μL 混合，制成質(zhì)控樣品。

1.2.3 質(zhì)譜條件 AB 5600+Triple TOF 質(zhì)譜儀能夠在控制軟件（Analyst TF 1.7，AB Sciex）控制下基于IDA 功能進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，一級(jí)掃范圍m/z（50～1 000），二級(jí)掃范圍m/z（25～1 000），二級(jí)轟擊能量：30 eV。ESI 離子源參數(shù)設(shè)置如下：霧化氣壓（GS1）：55 Pa，輔助氣壓：55 Pa，氣簾氣壓：40 Pa，溫度：550 ℃，噴霧電壓：5 500 V（正離子模式）。技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)參照我國(guó)GB/Z 35959-2018 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析方法通則。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 轉(zhuǎn)格式：數(shù)據(jù)首先使用Analysis-BaseFileConverter 轉(zhuǎn)換為.abf 格式。使用MSDIAL軟件對(duì)轉(zhuǎn)換后的abf文件進(jìn)行尋峰、峰對(duì)齊、歸一化等處理，同時(shí)基于一級(jí)和二級(jí)圖譜搜索MassBank、MoNA、Respect、GNPS 數(shù)據(jù)庫(kù)，得到鑒定結(jié)果。

MSDIAL 軟件設(shè)置參數(shù)：Alignment：MS1 tolerance 0.01 Da；Retention time tolerance 0.3 min；Identification：Accurate mass tolerance（MS1）：0.007Da（MS2）：0.03 Da

對(duì)于MSDIAL 對(duì)齊鑒定出來(lái)數(shù)據(jù)，通過質(zhì)控樣品控制樣品指標(biāo)變異系數(shù)值小30%，然后刪除組內(nèi)缺失值＞50%的離子峰。采用Pareto-scaling 方法進(jìn)行歸一化，應(yīng)用MetaboAnalyst 軟件進(jìn)行差異分析和富集分析。

2 結(jié)果

2.1 入組情況

實(shí)驗(yàn)組（G1）20 例，均為食管鱗癌，從2018 年1月至2019年5月收治的經(jīng)病理學(xué)明確診斷的患者。男性18 例，女性2 例；年齡34～67（58.6±7.25）歲。其中T2N1M0 5 例，T3N1M0 14 例，T4N0M0 1 例，分期構(gòu)成IIIA 期5 例，IIIB 期15 例；腫瘤位于胸上段2例，胸中段10 例，胸下段8 例。對(duì)照組（G2）為健康人群，男性17 例，女性3 例；年齡42～69（50.3±9.25）歲。兩組均簽訂實(shí)驗(yàn)知情同意書。比較實(shí)驗(yàn)組和健康對(duì)照組的年齡和性別構(gòu)成比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制

2.2.1 總離子流圖 將10 次分析得到質(zhì)量控制（quality control，QC）樣本的總離子流圖，進(jìn)行譜圖重疊比較。（圖1）。理論上，QC 樣本是一樣的，但在物質(zhì)提取、檢測(cè)分析過程中會(huì)有系統(tǒng)誤差，導(dǎo)致QC 樣本之間出現(xiàn)差異，這個(gè)差異越小，說明系統(tǒng)的穩(wěn)定性越好，數(shù)據(jù)的質(zhì)量也越高。

圖1 10次QC樣本的總的離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of 10 QC samples

2.2.2 主成分分析 從每個(gè)樣品中提取適量待檢測(cè)液（常規(guī)量為10 μL）進(jìn)行等量混合作為實(shí)驗(yàn)的QC 樣品。將QC 樣本與測(cè)試樣本檢出的全部峰進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA；圖2）。

圖2 PCA 2D得分圖Fig.2 PCA 2-dimensional score chart

2.3 代謝物鑒定結(jié)果

通過軟件MS_DIAL 進(jìn)行峰尋找、峰對(duì)齊等數(shù)據(jù)處理，同時(shí)基于一級(jí)與二級(jí)圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)種化合物圖譜進(jìn)行匹配，得到鑒定結(jié)果。對(duì)無(wú)法與數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)應(yīng)的峰另外進(jìn)行圖譜預(yù)測(cè)，得到預(yù)測(cè)結(jié)果。下圖展示每個(gè)樣品檢出的代謝物質(zhì)及鑒定出物質(zhì)的多少。本實(shí)驗(yàn)檢出總物質(zhì)峰1 849 個(gè)，符合二級(jí)圖譜1 388個(gè)，共鑒定出物質(zhì)402種（圖3）。

2.4 樣品差異性分析

通過主成分分析（圖4）等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法在樣品全局代謝物含量的水平比較樣品間的差異（均一性）。

2.5 單變量分析

本項(xiàng)目采用變異倍數(shù)（Fold Change，F(xiàn)C）分析、t檢驗(yàn)對(duì)代謝物進(jìn)行單變量統(tǒng)計(jì)分析，并繪制火山圖（圖5）。顯示出樣本間代謝物具有顯著性變化。單變量分析的差異代謝物，共21種。

2.6 多變量分析

采用偏最小二乘回歸分析法（partial least squares regression analysis，PLSDA）分析。圖6 可以看出，兩組樣品分布相距較遠(yuǎn)，并分別集中在各自區(qū)域，表明兩組樣品含量差異明顯。

2.7 差異指標(biāo)篩選結(jié)果

本項(xiàng)目以P＜0.05、Fold Change 大于2 倍且VIP值＞1作為差異代謝指標(biāo)的篩選標(biāo)準(zhǔn)（表1，圖7）。

3 討論

惡性腫瘤的本質(zhì)是基因疾病，也是代謝性疾病，其發(fā)生、發(fā)展、對(duì)放化療的敏感性和毒副反應(yīng)也是由基因的異常導(dǎo)致的，但從基因的異常到出現(xiàn)功能表現(xiàn)的差異，當(dāng)中經(jīng)歷了極其復(fù)雜的生化過程，主要是由患者個(gè)體、抗腫瘤治療和腫瘤本身三者的共同作用結(jié)果。以代謝組學(xué)為基礎(chǔ)去研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展，具有客觀準(zhǔn)確、高效直接的優(yōu)點(diǎn)。目前對(duì)于乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等應(yīng)用代謝組學(xué)已進(jìn)行早期診斷的研究［4-9］。由此看來(lái)，食管癌也應(yīng)該有其本身獨(dú)特的代謝特點(diǎn)，可以用于揭示其腫瘤內(nèi)在的生理生化過程，甚至可能進(jìn)一步上推反證至基因調(diào)控的異常。本研究嘗試比較食管鱗癌患者和正常人血清代謝組學(xué)的差異，尋找食管癌特異性的血清代謝產(chǎn)物，為了解食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展及早期診斷提供線索，也為下一步食管癌放化療敏感性的評(píng)估提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

目前食管癌的代謝組學(xué)研究已經(jīng)不少，但研究設(shè)計(jì)差異大、使用的標(biāo)本不同、采用的檢測(cè)方法、條件也不統(tǒng)一，故結(jié)果相差甚大，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差。既往一些基于核磁共振波譜的代謝組學(xué)研究［10-11］表明，食管癌患者尿液中的代謝物成分不同于健康對(duì)照組，然而篩選的差異代謝成分的一致性差，有研究嘗試比較食管癌腫瘤組織和尿液的代謝譜的關(guān)聯(lián)性，評(píng)估以尿液作為檢驗(yàn)樣本的可靠性，結(jié)果表明患者腫瘤組織和尿液之間的明顯代謝特征和代謝途徑紊亂存在一定的關(guān)聯(lián)性，尿液代謝特征的變化是如何反映食管腫瘤組織中代謝情況，當(dāng)中也可能經(jīng)歷了一系列生化過程，仍需要進(jìn)一步的研究［12］。由于代謝組學(xué)中遇到的生物樣品的復(fù)雜性，為了盡可能多地檢測(cè)代謝物，質(zhì)譜（mass spectrometer，MS）分析通常與分離技術(shù)結(jié)合使用，常用的分離方法包括氣相色譜（gas chromatography，GC）、液相色譜（liqiud chromatography，LC）。氣相色譜適合于熱穩(wěn)定性好或具揮發(fā)性的化合物分離。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)則融合了液相色譜的高效及快速分離效能和質(zhì)譜的高敏感性及高特異性優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于極性、難揮發(fā)性或大分子化合物等復(fù)雜生物樣品來(lái)說，是測(cè)定分析的理想選擇［13］。故本研究仍采用LC-MS 作為主要檢測(cè)技術(shù)。樣品制備是代謝組學(xué)的關(guān)鍵步驟。因此，一個(gè)全面和系統(tǒng)的組織制備方案篩選策略是非常可取的。我國(guó)有作者研究開發(fā)了一種基于LC-MS 的優(yōu)化和評(píng)估策略，以篩選針對(duì)不同類型內(nèi)源性代謝物（氨基酸、肉堿、膽堿等）的高提取效率和可重復(fù)性食管組織制備方案，并特別關(guān)注低水平代謝物，建立了一種穩(wěn)定性、敏感性和重復(fù)性都較好的方案，稱為“逐步加入溶劑和均勻化濕組織方案”（stepwise addition of solvents and a homogenized wet tissue protocol，SWHW）［14］。由此可見，在實(shí)驗(yàn)的樣品選擇、制備過程至關(guān)重要。

表1 物質(zhì)差異結(jié)果綜合統(tǒng)計(jì)表Table 1 comprehensive statistical table of substance difference

圖3 各組樣品檢出的物質(zhì)峰數(shù)量Fig.3 Number of peaks detected in each group

本研究最終篩選出6 種差異性代謝標(biāo)記物：肌苷（inosine）、苯丙氨酸二肽（Phe Phe）、羥基吲哚硫酸（indoxylsulfuric acid）、2-順式二十烯酸（2-cis eicosenoic acid）、硫酸普萘諾酮（pregnanolone sulfate）、δ-戊丙酰胺（delta-valerolactam）。然而進(jìn)一步通過富集分析發(fā)現(xiàn)上述差異性代謝物，與氧化磷酸化、精氨酸的生物合成、鈣信號(hào)通路、產(chǎn)熱效應(yīng)、醛固酮的合成與分泌、嘌呤代謝。其中可信度較高的是嘌呤代謝途徑。盡管上述的代謝物參與的代謝途徑不同，但通過富集分析，通路檢索發(fā)現(xiàn)，各條通路中多數(shù)呈能量代謝的異常，其中4 個(gè)可見還原型輔酶Ⅰ（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）的下調(diào)。NADH是一種化學(xué)物質(zhì)，是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的還原態(tài)。因NADH 主要在細(xì)胞中參與物質(zhì)和能量代謝，產(chǎn)生于糖酵解和細(xì)胞呼吸作用中的檸檬酸循環(huán)，并作為生物氫的載體和電子供體，在線粒體內(nèi)膜上通過氧化磷酸化過程，轉(zhuǎn)移能量供給三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合成，所以NADH 又被稱為線粒體素。理論上，1分子NADH 釋放的能量，可以合成2.5 分子ATP。無(wú)氧條件下，葡萄糖代謝所產(chǎn)生的ATP 是十分少的。而有氧條件下，經(jīng)過糖酵解和三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的NADH 或還原型黃素二核苷酸（flavine adenine dinucleotide，reduced，F(xiàn)ADH2）經(jīng)由氧化磷酸反應(yīng)可產(chǎn)生大量的ATP；NADH 的量與產(chǎn)生量直接相關(guān)，每個(gè)細(xì)胞所含的NADH 越多，所產(chǎn)生的能量越多，需要能量越多的器官，其所含的（或所需的）NADH 的量也越高。然而，本研究中的差異代謝的多條代謝通路過程中顯示NADH 和肌苷下調(diào)，顯示食管癌患者的代謝水平高，消耗嚴(yán)重，導(dǎo)致體內(nèi)NADH 和肌苷明顯下調(diào)，這可能是長(zhǎng)時(shí)間能量代謝增強(qiáng)導(dǎo)致儲(chǔ)備消耗的結(jié)果。但這種消耗是因?yàn)槟[瘤本身的代謝因素所致還是食管癌患者長(zhǎng)期不能進(jìn)食導(dǎo)致的機(jī)體消耗所致的結(jié)果，目前難以明確，但NADH 的下調(diào)可以作為診斷和篩查的重要參考因素。

圖4 代謝物含量均一性主成分分析圖Fig.4 principal component analysis of metabolite con?tent homogeneity

圖5 數(shù)據(jù)結(jié)果的火山圖Fig.5 Volcano plot of data results

圖6 PLSDA 得分圖Fig.6 PLSDA shot chart

圖7 VIP 值分布圖表Fig.7 VIP value distribution chart

綜上所述，盡管本研究作為小樣本的實(shí)驗(yàn)研究，具有一定局限性，但結(jié)果仍顯示食管鱗癌和正常對(duì)照組之間的血清代謝譜存在明顯差異，主要表現(xiàn)在能量代謝上的過度消耗，值得進(jìn)一步深入研究。