李偉偉，劉 聰，閆婭妮，殷秀榮△，史鳳穎，李麗瑋

(河北省秦皇島市婦幼保健院：1.生殖醫(yī)學(xué)科；2.產(chǎn)科 066000)

目前，隨著女性生育年齡的延遲和生育能力的降低，不孕癥已經(jīng)成為全社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)。輔助生殖技術(shù)(ART)近年來成為不孕不育患者有效的治療方法。隨著ART技術(shù)的優(yōu)化，胚胎質(zhì)量有了較大的提高和改善，但胚胎的著床率仍然不高，所以ART中胚胎的著床問題已成為提高妊娠率的限制性問題。胚胎植入成功與否不僅取決于胚胎發(fā)育成囊胚的潛能，更決定于內(nèi)膜的容受性狀態(tài)[1-2]。胚胎反復(fù)植入失敗(RIF)降低了體外受精(IVF)的妊娠率，近年來成為輔助生殖領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。胚胎RIF目前尚未有統(tǒng)一的定義，主要觀點(diǎn)認(rèn)為移植大于或等于3個(gè)周期，且均有優(yōu)質(zhì)胚胎移植，但是未獲得妊娠[3]。內(nèi)膜的容受性是指內(nèi)膜對(duì)胚胎的接受能力，子宮內(nèi)膜種植窗持續(xù)時(shí)間較短，種植窗期內(nèi)膜對(duì)胚胎的接受能力決定移植成功的關(guān)鍵因素。

激活素(Activin)和卵泡抑素(FST)是細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族的成員，主要由垂體細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞分泌[4]。通過內(nèi)分泌及自(旁)分泌調(diào)節(jié)作用參與了女性體內(nèi)眾多的生殖生理活動(dòng)。FST和Activin存在于人的子宮內(nèi)膜和輸卵管上皮細(xì)胞，在月經(jīng)周期中調(diào)節(jié)內(nèi)膜的生理性改變[5]。FULLERTON等[6]學(xué)者認(rèn)為，F(xiàn)ST在小鼠子宮內(nèi)膜的容受性和蛻膜化過程中發(fā)揮了重要的作用。 PRAKASH等[7]研究顯示，與健康可育女性相比，RIF女性子宮內(nèi)膜上皮腺細(xì)胞中FST的表達(dá)水平明顯降低。FST通過與TGF-β超家族的共有β亞單位結(jié)合，從而拮抗其結(jié)合物的生物活性。CRUZ等[8]研究表明，子宮內(nèi)膜的FST缺失，將會(huì)導(dǎo)致內(nèi)膜對(duì)雌激素和孕酮的信號(hào)不應(yīng)答，所以胚胎無法著床于內(nèi)膜，不能妊娠。本研究旨在探討Activin B、FST與RIF患者的關(guān)系及其影響機(jī)制，從而對(duì)IVF周期中發(fā)生RIF的風(fēng)險(xiǎn)做出預(yù)測(cè)，并為臨床治療提供更為科學(xué)的指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年5月至2019年12月在本院生殖醫(yī)學(xué)科進(jìn)行ART[IVF與胚胎移植(ET)或卵泡漿內(nèi)單精子顯微注射(ICSI)]治療的不孕患者，其中由于男方因素或者輸卵管因素于本院首次進(jìn)行ART助孕后妊娠并分娩的患者作為對(duì)照組；至少進(jìn)行3次移植(新鮮或者解凍的胚胎，每次至少有1枚優(yōu)質(zhì)胚胎，移植優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)大于或等于4)均未妊娠的患者作為RIF組；每組15例。 兩組患者進(jìn)入周期前評(píng)估，卵巢儲(chǔ)備功能尚好，同意選擇常規(guī)的方案進(jìn)行控制性促排卵。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合不孕癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡23～37歲；(3)進(jìn)行3次及以上取卵周期并每個(gè)周期有1個(gè)優(yōu)質(zhì)胚胎移植而未孕；(4)基礎(chǔ)內(nèi)分泌正常，且有正常月經(jīng)周期；(5) 進(jìn)入周期前6個(gè)月未進(jìn)行過宮腔操作或使用激素類藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1) 宮腔異常形態(tài)；(2) 染色體異常或其他遺傳因素引起的RIF；(3)既往有卵巢功能不全 、卵巢早衰 、多囊卵巢綜合征等影響卵巢反應(yīng)性的疾病；(4)子宮內(nèi)膜異位癥患者；(5)可移植的優(yōu)質(zhì)胚胎(7個(gè)細(xì)胞以上，碎片小于10%的卵裂胚，或者4BB、5BB的囊胚)<2個(gè)；(6) 有傳染性疾?。?7) 輸卵管積水。本研究經(jīng)秦皇島市婦幼保健院倫理委員會(huì)討論通過，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1內(nèi)膜標(biāo)本的采集

所有研究對(duì)象的內(nèi)膜均在進(jìn)入治療周期前1個(gè)月經(jīng)周期的第21～22天[體內(nèi)促黃體生成素(LH)峰的第7天]或排卵后第6天行宮腔鏡取內(nèi)膜或者子宮內(nèi)膜刺激時(shí)留取。將內(nèi)膜一式兩份，一份送病理科用于切片和免疫組織化學(xué)(IHC)檢查，一份保存于液氮中用于FST、Activin B、骨形態(tài)蛋白4(BMP4)及Smad3的Western blot檢測(cè)。并收集該日的空腹靜脈血2 mL，離心取上清液，保存于-20 ℃待用。

1.2.2內(nèi)膜組織總蛋白的提取

總蛋白提取試劑盒購自北京索萊寶有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行提取蛋白。迅速從液氮中取出內(nèi)膜組織放于冰上，融于室溫下。用剪刀剪碎組織后，稱取0.1～0.2 g組織，置于干凈的離心管內(nèi)，加入500 μL組織裂解液(已加入蛋白酶抑制劑),然后用組織勻漿器勻漿至無明顯固狀物質(zhì)。吸取勻漿于預(yù)冷的尖底離心管內(nèi)，4 ℃，10 000 r/min，離心5 min，吸取上清液于-80 ℃保存待用。

1.2.3采用Western blot檢測(cè)內(nèi)膜組織中FST、Activin B、BMP4和Smad3蛋白的表達(dá)

采用牛血清蛋白(BCA)法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)吸光度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算蛋白的濃度。根據(jù)蛋白濃度計(jì)算上樣量。本研究實(shí)驗(yàn)的樣品量為20 μL，上樣量為30 μg。臨用前加入最終的樣品緩沖液:2%十二烷基硫酸鈉(SDS)、100 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)、60 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris，pH 6.8)、0.01%溴酚藍(lán)和10%甘油。在電極(正極)上依次疊放聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和凝膠。轉(zhuǎn)膜結(jié)束，將膜浸入封閉液(含5%脫脂奶粉的Tris緩沖鹽)中緩慢振蕩后洗滌;加一抗(FST一抗購自invitrogen,批號(hào)AB_10982080；Activin B抗體ProSpec，批號(hào)：CYT-058;BMP4抗體購自abcam，批號(hào)：ab209851；Smad3抗體購自abcam，批號(hào)：ab40854)4 ℃緩慢振蕩過夜；加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶10 000稀釋)，室溫緩慢振蕩2 h后洗滌;以β-action作為內(nèi)參，采用Quantity One軟件將條帶轉(zhuǎn)化為灰度值，蛋白表達(dá)量=目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.2.4采用免疫發(fā)光法測(cè)定性激素和抗繆勒管激素(AMH)的水平

采用羅氏公司的Cobas601測(cè)定兩組患者基礎(chǔ)的內(nèi)分泌水平，包括雌二醇(E2)、孕酮(P)、LH、卵泡刺激素(FSH)的水平及AMH的水平，每個(gè)結(jié)果測(cè)定3次，取平均值。

1.2.5觀察指標(biāo)及隨訪

參照歐洲輔助生殖會(huì)議，RIF定義：3次及以上優(yōu)質(zhì)胚胎移植未妊娠或移植大于 10 枚胚胎未妊娠[9]。胚胎質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照 Brown′s 形態(tài)學(xué)評(píng)分系統(tǒng)評(píng)分[10]。優(yōu)質(zhì)胚胎定義:胚胎評(píng)級(jí)為Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)的胚胎。采用超聲監(jiān)測(cè)移植日內(nèi)膜厚度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者一般資料比較

兩組患者年齡、不孕年限、體重指數(shù)(BMI)、不孕原因、不孕類型、受精方式比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組患者一般資料比較(n=15)

2.2 兩組患者性激素及AMH水平的比較

兩組患者基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平和AMH的水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.3 兩組患者控制性促排卵及移植日內(nèi)膜厚度比較

扳機(jī)日比較兩組患者的E2、P、獲卵數(shù)、促性腺激素(Gn)用量、注射Gn時(shí)間等，兩組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組患者移植日內(nèi)膜的厚度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表2 兩組患者基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平及AMH水平比較

表3 兩組患者控制性促排卵情況比較

2.4 兩組患者內(nèi)膜FST 和Actvin B表達(dá)水平比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，RIF組FST蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，RIF組Actvin B蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4、圖1。

表4 兩組患者FST、ActivinB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖1 兩組患者FST和Activin B蛋白表達(dá)

2.5 兩組患者內(nèi)膜BMP4和Smad3表達(dá)水平比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，RIF組BMP4蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，RIF組Smad3蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表5、圖2。

表5 兩組患者BMP4、Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖2 兩組患者Smad3和 Bmp4蛋白的表達(dá)

3 討 論

ART技術(shù)已經(jīng)成為不孕患者的主要治療手段，但仍然有些不孕女性存在RIF的情況，目前如何解決此問題成為輔助生殖領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。高質(zhì)量的胚胎和良好的內(nèi)膜容受性是胚胎成功妊娠的關(guān)鍵因素。子宮內(nèi)膜在植入期間和蛻膜期間會(huì)受許多因素的影響，這些因素可能對(duì)IVF成功妊娠的結(jié)局至關(guān)重要。REFAAT[11]提出Activin及其相關(guān)蛋白在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性，滋養(yǎng)細(xì)胞活性和胚胎著床中起著重要作用。這些候選蛋白的病理表達(dá)與植入異常和早孕失敗有關(guān)。有研究表明，在流產(chǎn)、反復(fù)流產(chǎn)、妊娠期高血壓及IVF后RIF的婦女中，F(xiàn)ST、Activin和抑制素的表達(dá)與調(diào)節(jié)存在異常[12-15]。本文主要研究子宮內(nèi)膜容受性的相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，在蛋白水平上研究子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)控，以改善內(nèi)膜的容受性，提高ART的成功率及胚胎的利用率。

子宮內(nèi)膜在雌孕激素的作用下，發(fā)生增殖、分泌，出現(xiàn)短暫的種植窗，一部分基質(zhì)細(xì)胞分化為蛻膜細(xì)胞。有學(xué)者研究表明，Activin和FST在子宮內(nèi)膜異位癥患者的內(nèi)膜中表達(dá)增加[16]，說明FST和Activin在子宮內(nèi)膜的蛻膜化的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。有研究在2006年報(bào)道，Actvin A在子宮內(nèi)膜在蛻膜化的細(xì)胞中高度表達(dá)[17]。本研究結(jié)果表明,RIF組患者FST蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組，說明FST的缺失可能是RIF的影響因素，但是具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本研究進(jìn)一步檢測(cè)下游基因，RIF組的BMP4蛋白水平明顯降低，而Smad3蛋白的表達(dá)量明顯增高(P<0.05)。在臨床工作中，可以用FST和Activin B在內(nèi)膜上的表達(dá)情況預(yù)測(cè)RIF的情況，從而為患者節(jié)省胚胎、減輕其心理負(fù)擔(dān)。

綜上所述，RIF患者種植窗期，子宮內(nèi)膜FST蛋白缺失，Actvin B蛋白增加，說明其在內(nèi)膜容受性中均起到重要的調(diào)節(jié)作用，可能會(huì)導(dǎo)致胚胎不能成功著床。由于本研究的樣本量不夠多，可能存在一定的誤差性，但是仍然希望本研究能夠?qū)RT中發(fā)生RIF的風(fēng)險(xiǎn)做出預(yù)測(cè)，并為臨床治療提供更為科學(xué)的指導(dǎo)。