葉惠閩，黃顯清，張雪洪

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物代謝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240）

0 引言

原核生物的表觀遺傳是在不改變DNA 序列的前提下［1］，通過DNA甲基化、組蛋白修飾或RNA沉默［2］等遺傳機(jī)制調(diào)控特定基因的表達(dá)。其中，DNA 甲基化協(xié)助調(diào)控胞內(nèi)生理過程是原核生物中表觀修飾的研究熱點(diǎn)，細(xì)菌中不同的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制具有多樣性［3］。

DNA 甲基化是由DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA Methyltransferase，MTases）催化，以S-腺苷甲硫氨酸為供體，將甲基基團(tuán)添加到腺嘌呤或胞嘧啶上［4-5］。DNA甲基化檢測方法發(fā)展快速，根據(jù)對目標(biāo)DNA的前處理手段可將檢測技術(shù)分為3 類：基于限制性酶切預(yù)處理［6］，基于亞硫酸鹽修飾預(yù)處理和基于親和富集預(yù)處理的甲基化檢測技術(shù)［7］。根據(jù)檢測目標(biāo)片段可以分為特異位點(diǎn)的甲基化檢測和全基因組的甲基化分析［8］。

重亞硫酸鹽測序技術(shù)（Bisulfite Sequencing PCR，BSP）以高精度的單堿基分辨率和相對較低的檢測成本，可以作為短片段DNA甲基化的檢測技術(shù)［9］。其測序利用了DNA片段經(jīng)重亞硫酸鹽處理氧化變性，而甲基化的胞嘧啶（Cytosine，C）因受到甲基基團(tuán)保護(hù)未被氧化而保持不變［10］。

實(shí)際過程中基因組通常只有一小部分具有被甲基化的潛力，故常不需要全基因組甲基化測序，因此建立基因片段的甲基化檢測方法同樣具有廣闊的應(yīng)用前景。對基因組中富含甲基胞嘧啶的部分來講，BSP 是一種相對節(jié)約檢測成本的方法，并且允許測序覆蓋范圍的增加，從而提高探測差異甲基化區(qū)域的準(zhǔn)確性和便捷度［11］。

綠針假單胞菌HT66 是一株高產(chǎn)吩嗪-1-甲酰胺（PCN）的菌株。前期研究發(fā)現(xiàn)，HT66 高產(chǎn)菌株篩選中所得的表型變異菌株HT66-FLUO 完全喪失了合成PCN的代謝能力，鐵載體的合成能力卻有所增強(qiáng)，對高產(chǎn)菌株的篩選帶來了許多干擾和不便。吩嗪和鐵載體的合成和分泌受到GacA/S 雙組份系統(tǒng)的調(diào)控。劉洋等［12］發(fā)現(xiàn)HT66 與HT66-FLUO在DNA水平上并無差異，并通過實(shí)驗(yàn)推測HT66-FLUO 的gacS 可能發(fā)生了DNA水平的修飾或翻譯后修飾。

為了進(jìn)一步探究導(dǎo)致HT66-FLUO中GacS蛋白激酶失活的原因，尋找表型變異與全局調(diào)控雙元系統(tǒng)GacA/S之間的關(guān)系，研究HT66-FLUO在DNA水平上的變異機(jī)制。本文建立了一種適合細(xì)菌單基因片段的準(zhǔn)確、快速的BSP 甲基化測序方法，測定了HT66 和HT66-FLUO中g(shù)acS 的甲基化差異位點(diǎn)，為菌株變異機(jī)制的闡明提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為其他細(xì)菌中單基因甲基化位點(diǎn)的檢測提供了參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kit（QIAGEN，59824）；pTG19-T（Generay，GV6021）；TOPO10（Generay，DL1010）；HiPure Gel Pure Micro Kit（Magen，D2110）；HiPure Bacterial DNA Kit（Magen，D3146）；HiPure Plasmid Maxi Kit（Magen，P1004）；POP7、HI-DI Formamide（Thermo Fisher Scientific，1912674）。NanoDrop-2000 超微量紫外可見分光光度儀（Thermo Fisher Scientific）；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)（上海天能公司）；PCR 儀（ABI）；核算提取儀（NanomagBio）；3730XL測序儀（ABI）

1.2 菌株與引物

本文所用到的菌株、引物和質(zhì)粒如表1 所示。

表1 本文所用到的菌株、引物和質(zhì)粒

1.3 培養(yǎng)基和菌株生長條件

綠針假單胞菌HT66 和HT66-FLUO選用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)；工程菌株和種子菌株保種和復(fù)蘇時使用KB培養(yǎng)基（King’s B液體培養(yǎng)基）［13-14］培養(yǎng)；大腸桿菌使用LB培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基中加入12 g/L的瓊脂粉即為相應(yīng)的固體培養(yǎng)基。

綠針假單胞菌在恒溫?fù)u床或培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)（28 ℃、180 r/min）。

1.4 微生物菌體收集與總DNA 提取

將甘油凍存保種的綠針假單胞菌HT66 和HT66-FLUO取出，劃線于KB固體培養(yǎng)基中完成第1 輪復(fù)蘇活化，培養(yǎng)至約48 h 取合適的單菌落。經(jīng)KB 培養(yǎng)液多次稀釋后均勻涂布于KB平板完成第2 次活化。將單菌落接種于裝有5 mL LB 液體培養(yǎng)基的玻璃小瓶中，過夜培養(yǎng)。取上述發(fā)酵液，每株菌設(shè)置3 個平行樣本，分別提取總DNA，具體實(shí)驗(yàn)步驟遵循HiPure Bacterial DNA Kit（Magen，D3146）說明書。將提取到的菌株基因組通過NanoDrop-2000 測定在260 和280 nm的吸收值，對DNA的濃度和質(zhì)量進(jìn)行評估。同時，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步分析提取的基因組。

1.5 BSP實(shí)驗(yàn)

取上述實(shí)驗(yàn)得到的合格DNA提取樣品，進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化等后續(xù)試驗(yàn)，BSP 實(shí)驗(yàn)總過程大致如圖1所示。

圖1 重亞硫酸鹽法測序?qū)嶒?yàn)流程圖［15-16］

1.5.1 亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)試劑準(zhǔn)備

BW緩沖溶液：向BW 濃縮液中加入30 mL 無水乙醇，混勻。BD緩沖液：向BD 濃縮液中27 mL 無水乙醇，混勻。

1.5.2 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化DNA

亞硫酸鹽處理操作步驟按照試劑盒說明書操作（QIAGEN，cat：59824），取1 μg 基因組DNA 進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化并純化回收。重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換程序如表2所示。

表2 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化程序

1.5.3 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后DNA純化

離心PCR管并將液體轉(zhuǎn)移到1.5 mL 離心管內(nèi)，加入310 μL 新鮮配制的BL 溶液。渦旋混合均勻后瞬時離心，以下的離心條件均在室溫下進(jìn)行（15～25℃）。依次添加溶液到離心柱內(nèi)共洗滌離心5 次，順序?yàn)闊o水乙醇、BW 溶液（洗液）、BD 溶液（脫磺酸基緩沖液）、BW溶液、無水乙醇。將離心柱放到一個新的1.5 mL離心管內(nèi)。將15 μL EB緩沖溶液（洗脫緩沖液）直接加到離心柱的膜中心。15 000g 離心1 min洗脫DNA，純化后的DNA儲存在-20 ℃。

1.5.4 PCR 擴(kuò)增

通過甲基化引物設(shè)計軟件MethPrimer 預(yù)測gacS基因序列的CpG島位置與位點(diǎn)，并在非CpG位點(diǎn)區(qū)設(shè)計3 對特異性引物，進(jìn)而將兩菌株的gacS 分成3 個DNA片段，片段長度依次分別為342 bp、294 bp和354 bp，引物序列見表1，分別取上游、下游引物（10 μmol/L）各1 μL、10*Taq Buffer（3 μL）、Taq 酶（1 μL）、dNTP（1 μL）、模板（2 μL），并加入21 μL 的ddH2O補(bǔ)齊30 μL 體系。根據(jù)表3 所示的PCR 反應(yīng)程序分別對3 個對應(yīng)片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物按照試劑盒中的HiPure Gel Pure Micro Kit（Magen，D2110）產(chǎn)品說明操作，將目標(biāo)片段割膠純化。

表3 PCR程序

1.5.5 T/A克隆與測序

（1）連接T 載體。采用pTG19-T（Generay，GV6021）作為載體，將上述純化后的PCR 產(chǎn)物與pTG19-T載體連接。首先離心載體及control insert，之后按照表4 的體系配置混勻體系，充分離心，在22 ℃連接1 h。

表4 pTG19-T載體連接反應(yīng)體系 μL

（2）轉(zhuǎn)化和挑取質(zhì)粒送測序。采用感受態(tài)細(xì)胞（Generay，DL1010）將T載體連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化、復(fù)蘇和涂板。通過藍(lán)白斑篩選，挑取白斑進(jìn)行驗(yàn)證，篩選出轉(zhuǎn)化成功的陽性克隆。通過基因測序確保重組質(zhì)粒成功克隆。將含有重組質(zhì)粒的陽性菌落挑至LB 液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。按照HiPure Plasmid Maxi Kit（Magen，P1004）說明書提取重組質(zhì)粒，置于-20 ℃儲藏。同時，用60%甘油保種TOPO10 陽性克隆菌株以備后續(xù)使用。鑒定轉(zhuǎn)化成功的陽性質(zhì)粒，挑取同一樣品的10 個克隆為一組平行完成測序。Sanger 測序由上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.5.6 測序結(jié)果分析

將測序產(chǎn)生的原始讀序列進(jìn)行生物信息技術(shù)處理［17］：刪掉原始讀序列中PHRED≤2 的低質(zhì)量堿基之后的所有堿基；搜索并刪除讀序列兩端的接頭寡核苷酸；將讀序列中的C 替換為T。為保證甲基化測序的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，HT66 與HT66-FLUO 兩菌株的甲基化測序結(jié)果均取決于同一樣品的10 個克隆在gacS區(qū)域中不同位點(diǎn)的甲基化情況。測序結(jié)果經(jīng)BiQ Analyzer 2.0 軟件進(jìn)行分析，若gacS 區(qū)域位點(diǎn)上測得的胞嘧啶總數(shù)量多于根據(jù)二項分布模型所估算出的最少胞嘧啶數(shù)，即被認(rèn)定為甲基化位點(diǎn)。而特定CpG位點(diǎn)的甲基化水平指含甲基化胞嘧啶的原始讀序列數(shù)量占對應(yīng)位點(diǎn)上的所有覆蓋讀序列的百分比。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 BSP測序質(zhì)量評估

考慮到短片段DNA甲基化程度的同質(zhì)性，挑取同一樣品的10 個克隆進(jìn)行甲基化檢測，特定位點(diǎn)的甲基化比率應(yīng)是從樣品中分離出的所有DNA 的平均值。取對數(shù)生長期的綠針假單胞菌HT66 和HT66-FLUO完成細(xì)菌DNA的提取，經(jīng)NanoDrop-2000 測定其濃度與質(zhì)量，結(jié)果如表5 所示。兩菌株的DNA樣品較為完整，DNA降解和丟失量滿足下游應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)。分別對兩菌株的3 個片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果分別如圖2 所示。將目標(biāo)片段割膠純化后連接T載體，轉(zhuǎn)化TOPO10 感受態(tài)后選取適量有效陽性克隆提取質(zhì)粒，并應(yīng)用ABI3730 平臺進(jìn)行測序。兩組共20 個樣品測序結(jié)果良好，適合下一步數(shù)據(jù)分析。

表5 HT66 與HT66-FLUO提取DNA樣品的質(zhì)量檢測

圖2 重亞硫酸鹽修飾后PCR擴(kuò)增的電泳驗(yàn)證

2.2 測序結(jié)果與分析

測序結(jié)果經(jīng)BiQ Analyzer 2.0 軟件比較并分析后可知，表型突變株HT66-FLUO 中g(shù)acS 存在2 個甲基化位點(diǎn)，為便于敘述分別記作CpG1 和CpG2，如圖3、4所示。CpG1 和CpG2 在HT66-FLUO的gacS中甲基化率分別為50%和100%，可明確為高甲基化水平位點(diǎn)，而這兩個位點(diǎn)在出發(fā)菌株HT66 的gacS 中的甲基化率均為0。證實(shí)了原來的推測，確定了HT66-FLUO 的熒光表型變異是由于gacS中的堿基甲基化引起。

圖3 HT66-FLUO中g(shù)acS基因的甲基化CpG位點(diǎn)分布

圖4 HT66-FLUO中g(shù)acS甲基化CpG1與CpG2的甲基化頻率

假單胞菌HT66 中g(shù)acS 基因全長2 754 bp，甲基化修飾位點(diǎn)CpG1 和CpG2 所在位置分別是gacS編碼區(qū)末端的第2 421 位和第2 442 位堿基，并分別對應(yīng)第807 位組氨酸和第814 位組氨酸。通過對組氨酸激酶gacS的蛋白結(jié)構(gòu)域觀察（見圖5），可以看出兩個甲基化位點(diǎn)所對應(yīng)的組氨酸位置與HPT（組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域）鄰近，位于REC（磷酸化同源受體結(jié)構(gòu)域）和HPT之間。在假單胞菌的GacA/S雙組分調(diào)控中，gacS 屬于跨膜錨定蛋白，具有三重組氨酸傳感激酶，當(dāng)接受特定的外界信號或環(huán)境因子刺激后，通過一種未知的磷酸化機(jī)制激活下游應(yīng)答蛋白GacA，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對下游相關(guān)基因的表達(dá)［18］。鑒于此我們推測，gacS的甲基化通過影響甲基化位點(diǎn)臨近的HPT 結(jié)構(gòu)域間接阻礙了gacS磷酸基團(tuán)向GacA 的轉(zhuǎn)移過程，進(jìn)而影響GacA蛋白的調(diào)控功能。

圖5 gacS蛋白激酶結(jié)構(gòu)域示意圖

3 結(jié)語

細(xì)菌常通過自發(fā)的表型突變來應(yīng)對復(fù)雜多變的生存環(huán)境，表觀遺傳可以使同一菌株的基因組在核苷酸序列無變化的前提下發(fā)生相關(guān)功能的改變［19］。細(xì)菌中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控基因表達(dá)的方式繁多，機(jī)制復(fù)雜，目前假單胞菌中的表觀遺傳現(xiàn)象報道并不多見。DNA甲基化作為一類重要且廣泛的表觀調(diào)節(jié)方式［20］，其在假單胞菌中的發(fā)現(xiàn)、檢測和進(jìn)一步研究具有重要的科研價值。

對于甲基化測序方法的選擇，綜合文獻(xiàn)報道、待測序基因結(jié)構(gòu)和實(shí)驗(yàn)成本等多方面因素考慮，本研究選擇了分辨率達(dá)到單堿基水平的重亞硫酸鹽測序（BSP）技術(shù)。該測序技術(shù)靈敏度高，耗時短，實(shí)驗(yàn)成本相對較低。通過BSP技術(shù)對綠針假單胞菌HT66 及其表型突變株HT66-FLUO的同一基因片段gacS 并行測定，發(fā)現(xiàn)了HT66-FLUO的gacS 中存在2 個甲基化位點(diǎn)，為后續(xù)假單胞菌DNA甲基化機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。表明BSP檢測方法可應(yīng)用于細(xì)菌單基因的甲基化位點(diǎn)分析。