郭倩倩，周海芳，郝佳容，葉昀愷，曹 陽(yáng)，劉興泉，胡 浩

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300；2.國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院，北京 100037）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是一種非類(lèi)固醇霉菌毒素，廣泛存在于玉米、小麥、大麥等谷物及其加工副產(chǎn)物中[1]。該毒素主要由鐮刀菌屬（Fusariumsp.）真菌通過(guò)聚酮類(lèi)合成代謝途徑產(chǎn)生，具有生殖和發(fā)育毒性，細(xì)胞和遺傳毒性，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，可導(dǎo)致生殖器官發(fā)生癌變[2]。因此迫切需要相關(guān)手段對(duì) ZEN進(jìn)行清除、脫毒，從而保證谷物及其加工產(chǎn)物的安全性，對(duì)我國(guó)的糧食安全具有十分重要的意義。

清除ZEN主要通過(guò)化學(xué)、物理、生物三種方法[3]。物理化學(xué)清除法能耗高、易造成營(yíng)養(yǎng)損失，甚至造成二次污染[4]。生物清除法不易造成糧食的營(yíng)養(yǎng)成分流失，且具有專(zhuān)一性強(qiáng)、轉(zhuǎn)化率高、環(huán)境污染小等特點(diǎn)，已成為真菌毒素清除的研究熱點(diǎn)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)一株枯草芽孢桿菌在48 h內(nèi)對(duì)初始濃度為10 mg/L的ZEN降解率為99.7%[5]；一株解淀粉芽孢桿菌NS2對(duì)5 mg/L的ZEN標(biāo)準(zhǔn)品的降解率為96.0%[6]；11株對(duì)ZEN有降解能力的芽孢桿菌，72 h后其降解率在58%～96.9%[7]。上述研究表明，生物法對(duì)ZEN具有較好清除效果，但該法易受環(huán)境因素影響，穩(wěn)定性較差。

目前，用于ZEN生物降解的微生物主要為細(xì)菌、真菌、霉菌[8]。其中，根霉菌和酵母菌等可將 ZEN降解為低毒的 β-玉米赤霉烯醇或其他無(wú)毒產(chǎn)物。特別是酵母菌，降解效果好，其本身大多對(duì)人畜無(wú)致病性危害[9-10]，同時(shí)對(duì)多種脅迫、逆境具有較強(qiáng)耐受力、對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求低。西藏地區(qū)微生物不僅種類(lèi)豐富，而且受高海拔、強(qiáng)紫外線、低溫、低氧等環(huán)境因素影響，具有更好的功能特性和環(huán)境脅迫耐受能力。因此利用西藏地區(qū)菌種資源進(jìn)行糧食毒素清除研究更具應(yīng)用和開(kāi)發(fā)價(jià)值，且可克服生物清除效果穩(wěn)定性差的難題。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)酵母均由西藏大學(xué)提供，其中膠紅酵母（Rhodotorulamucilaginosa）為已鑒定保藏菌種（編號(hào)CGMCC10223），NYDA培養(yǎng)基4 ℃冰箱保存；甲醇（色譜級(jí)）、乙醇（色譜級(jí)）：Fisher科學(xué)世界公司；ZEN毒素標(biāo)準(zhǔn)品：北京百奧萊博公司；牛肉膏、無(wú)水葡萄糖、酵母粉、瓊脂粉：北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司；島津 8060NX液質(zhì)聯(lián)用色譜儀：日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 HPLC-FLD檢測(cè)條件

激發(fā)波長(zhǎng)274 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm；流動(dòng)相V（甲醇）∶V（水）=80∶20；流速1.5 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)條件

色譜檢測(cè)條件：液相系統(tǒng)流速：0.7 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20.0 μL；熒光檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：274 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：440 nm；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為色譜級(jí)甲醇。

質(zhì)譜檢測(cè)條件：電噴霧離子源（ESI）；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；離子源溫度：350 ℃；干燥氣流速度：9.0 L/min；霧化氣壓力：30 psi；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；碎裂電壓：0.1 kV；碰撞電壓：40 eV；檢測(cè)駐留時(shí)間：100 s。

1.3.3 酵母培養(yǎng)

1.3.3.1 培養(yǎng)基 NYDA培養(yǎng)基：牛肉膏8 g，無(wú)水葡萄糖10 g，酵母粉5 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL；NYDB培養(yǎng)基：牛肉膏8 g，無(wú)水葡萄糖10 g，酵母粉5 g，蒸餾水1 000 mL。培養(yǎng)基配置好后，高壓蒸汽滅菌（121 ℃，15 min）。

1.3.3.2 酵母菌活化 用無(wú)菌接種環(huán)挑取一環(huán)保存在4 ℃冰箱中的酵母接種于NYDA培養(yǎng)基中，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h。

1.3.3.3 液體培養(yǎng) 挑取一環(huán)經(jīng)活化后的酵母接種于裝有50 mL NYDB培養(yǎng)基的錐形瓶中，然后將上述培養(yǎng)液在 150 r/min，28 ℃下進(jìn)行搖床培養(yǎng)24 h。

1.3.3.4 調(diào)整濃度 將液體培養(yǎng)24 h后的酵母菌液，在4 ℃、5 000×g轉(zhuǎn)速下，離心10 min，除去上層清液，無(wú)菌水洗滌兩次后，再用無(wú)菌水重新懸浮。懸浮后的酵母細(xì)胞用無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，選擇試驗(yàn)所需濃度加入培養(yǎng)基。

1.3.4 清除ZEN的酵母菌株的篩選

在裝有50 mL NYDB培養(yǎng)基的錐形瓶中，加入1 mL濃度為1×108cells/mL的酵母菌懸液，再加入適量 ZEN儲(chǔ)備液，控制 ZEN初始濃度為5 μg/mL，在搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，分別在0 h和24 h取樣。對(duì)照組加入1 mL無(wú)菌水，設(shè)置三組平行。取樣品500 μL于1.5 mL離心管中，加入500 μL乙醇（HPLC級(jí)），渦旋震蕩均勻后，靜置30 min，用0.22 μm濾膜過(guò)濾后置于–20 ℃冰箱中保存待測(cè)。

1.3.5 酵母對(duì)ZEN的清除效果研究

1.3.5.1 酵母對(duì)不同濃度ZEN的清除效果 酵母培養(yǎng)方法同 1.3.3，ZEN 終濃度分別為 5、10、15 μg/mL，在搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，分別在0 h和24 h取樣。對(duì)照組加入1 mL無(wú)菌水，設(shè)置三組平行。取樣品500 μL于1.5 mL離心管中，加入500 μL乙醇（HPLC級(jí)），渦旋震蕩均勻后，靜置30 min，用0.22 μm濾膜過(guò)濾后置于–20 ℃冰箱中保存待測(cè)。

1.3.5.2 不同菌種濃度對(duì) ZEN清除效果的影響在裝有50 mL NYDB培養(yǎng)基的錐形瓶中，加入1 mL濃度分別為 1×106、1×107、1×108、1×109cells/mL的酵母菌液的酵母菌懸液，再加入適量ZEN儲(chǔ)備液，控制ZEN初始濃度為5 μg/mL，在搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，分別在0 h和24 h取樣。對(duì)照組加入1 mL無(wú)菌水，設(shè)置三組平行。取樣品500 μL于1.5 mL離心管中，加入500 μL乙醇（HPLC級(jí)），渦旋震蕩均勻后，靜置30 min，用0.22 μm濾膜過(guò)濾后置于–20 ℃冰箱中保存待測(cè)。

1.3.6 酵母清除ZEN的主要途徑研究

將活化培養(yǎng)得到的酵母細(xì)胞濁液分成三組進(jìn)行不同處理?；罱湍讣?xì)胞：用無(wú)菌水重新懸浮，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)將濃度調(diào)整為1×108cells/mL；熱殺死酵母細(xì)胞：將酵母菌懸液置于100 ℃水浴中加熱30 min殺死酵母，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)將濃度調(diào)整為1×108cells/mL；酵母上清液：將活化、培養(yǎng)后的酵母液，在4 ℃，5 000 r/min下離心10 min，取上清液用經(jīng)滅菌的0.22 μm濾膜過(guò)濾，得到無(wú)細(xì)胞濾液。加入適量ZEN儲(chǔ)備液，控制ZEN初始濃度分別為5 μg/mL，然后分別在50 mL NYDB培養(yǎng)基的錐形瓶中分別加入濃度為 1×108cells/mL的活酵母細(xì)胞和熱殺死酵母細(xì)胞懸浮液1 mL，在搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度28 ℃下培養(yǎng)48 h，分別在 0、6、12、18、24、30、36、48 h取樣。對(duì)照組加入1 mL無(wú)菌水，設(shè)置三組平行。將樣品在4 ℃，5 000 r/min下離心10 min后，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，取上清液500 μL于1.5 mL離心管中，加入500 μL乙醇（HPLC級(jí)），渦旋震蕩均勻后，靜置30 min使其充分浸提，置于–20 ℃冰箱中保存待測(cè)。

1.3.7 酵母ZEN降解作用的測(cè)定

酵母培養(yǎng)方法同1.2.3。對(duì)照組加入1 mL無(wú)菌水，處理組加入終濃度為5 μg/mL的ZEN，每個(gè)處理設(shè)置三組平行。每組樣品取500 μL于1.5 mL離心管中，加入500 μL乙醇（HPLC級(jí)），渦旋震蕩均勻后，靜置30 min，用0.22 μm濾膜過(guò)濾后利用LC-MS進(jìn)行產(chǎn)物測(cè)定。

1.3.8 脅迫耐受能力測(cè)定

1.3.8.1 氧化脅迫 制備濃度為 1×108cells/mL的酵母懸浮液，分別加入過(guò)氧化氫，制備過(guò)氧化氫終濃度為10、20和50 mmol/L的10 mL酵母懸浮液。將配制好的懸浮液在28 ℃，200 r/min下放置 40 min后，稀釋后，各取 100 μL涂布于NYDA平板，同體積未經(jīng)過(guò)氧化氫處理的酵母懸浮液為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)室釀酒酵母做對(duì)比。平板28 ℃培養(yǎng) 2天后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。3個(gè)平行處理，試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.3.8.2 低溫脅迫 低溫脅迫采用快速冷凍方法進(jìn)行。將培養(yǎng)好的西藏膠紅酵母用0.05 mol/L PBS緩沖液（pH 7）配制成濃度為1×108cells/mL的細(xì)胞懸浮液，取1 mL置于1.5 mL離心管中，在–80 ℃下快速冷凍30 min后取出，常溫水?。?5 ℃）孵育20 min，梯度稀釋后取100 μL涂布于NYDA平板，28 ℃下培養(yǎng)48 h后統(tǒng)計(jì)低溫處理前后菌落總數(shù)，同樣處理的實(shí)驗(yàn)室釀酒酵母為對(duì)照。3個(gè)平行處理，試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)每組處理設(shè)置3次平行，結(jié)果以均值±SD表示。采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。利用GraphPad Prism 8軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選降解ZEN的酵母

以西藏大學(xué)提供的西藏地區(qū) 10株酵母為研究對(duì)象，研究其在實(shí)驗(yàn)條件下對(duì) ZEN的清除效果，如表1所示，經(jīng)24 h培養(yǎng)后，西藏膠紅酵母對(duì)ZEN具有較好的清除效果，對(duì)ZEN的清除率達(dá)到90%以上，其余菌種對(duì)ZEN的清除效果則較為有限，因此，本試驗(yàn)選取西藏膠紅酵母開(kāi)展進(jìn)一步研究。

表1 不同酵母對(duì)ZEN的清除率Table 1 The elimination rate of ZEN by different yeasts

2.2 膠紅酵母對(duì)ZEN的清除效果研究

膠紅酵母對(duì)不同濃度ZEN清除效果的影響結(jié)果見(jiàn)表2所示，當(dāng)ZEN初始濃度為5 μg/mL時(shí)，經(jīng)24 h培養(yǎng)后，西藏膠紅酵母將 ZEN清除至0.19 μg/mL。當(dāng)ZEN初始濃度為10 μg/mL和15 μg/mL時(shí)，該酵母將ZEN清除至1.14 μg/mL和1.49 μg/mL。由此可見(jiàn)，隨著ZEN初始濃度的增加，膠紅酵母對(duì)ZEN的清除效果會(huì)有所降低，但其清除率仍可達(dá)80%以上。上述結(jié)果表明該酵母對(duì)ZEN的清除作用相對(duì)較為穩(wěn)定。不同濃度膠紅酵母懸浮液對(duì)ZEN的清除效果研究表明該酵母在低濃度時(shí)即可有效清除ZEN（見(jiàn)表3），隨著濃度的增加，其清除效果具有一定的提升。

表2 膠紅酵母對(duì)不同濃度ZEN清除效果的影響Table 2 Effect of R.mucilaginosa on the removal effect of ZEN at different concentrations

表3 不同濃度膠紅酵母對(duì)ZEN的清除效果Table 3 The removal effect of different concentrations of R.mucilaginosa on ZEN

2.3 膠紅酵母清除ZEN的作用途徑研究

試驗(yàn)通過(guò)評(píng)價(jià)不同膠紅酵母處理液對(duì)ZEN的清除效果來(lái)確定其主要作用途徑。如圖1所示，與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)滅活處理的酵母熱殺死液可以顯著降低培養(yǎng)基中ZEN含量。其中，前6 h對(duì)ZEN的清除效果與活酵母組基本相同，可使ZEN含量迅速降低，而活酵母組中ZEN含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)繼續(xù)降低，24 h時(shí)ZEN含量基本為0。酵母熱殺死液18 h后對(duì)ZEN的清除效果略遜于活酵母，30 h時(shí)無(wú)ZEN檢出，而酵母上清液對(duì)ZEN的清除效果較為有限。

圖1 膠紅酵母不同處理液對(duì)ZEN的清除作用Fig.1 The removal effect of different treatments of R.mucilaginosa on ZEN

試驗(yàn)結(jié)果表明，膠紅酵母對(duì)ZEN清除主要通過(guò)吸附作用進(jìn)行，酵母活細(xì)胞由于酵母活性較好，細(xì)胞數(shù)不斷增多，對(duì)培養(yǎng)基中ZEN可持續(xù)吸附；而酵母熱殺死液在細(xì)胞滅活時(shí)，可能由于部分細(xì)胞的葡聚糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，葡聚糖能夠通過(guò)糖苷鍵與毒素產(chǎn)生吸附作用[11]。

2.4 膠紅酵母對(duì)ZEN降解作用研究

為進(jìn)一步確定膠紅酵母是否在胞內(nèi)對(duì)ZEN具有降解作用，試驗(yàn)提取了酵母胞內(nèi)的ZEN，并利用LC-MS進(jìn)行了鑒定。通過(guò)比較圖2～4可知，西藏膠紅酵母吸附 ZEN后具有一定的降解作用，ZEN的降解產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量為320，可能是玉米赤霉烯醇或玉米赤霉酮。但其具體降解產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步的確認(rèn)。

圖2 西藏膠紅酵母對(duì)玉米赤霉烯酮的降解產(chǎn)物L(fēng)C-MS檢測(cè)色譜圖Fig.2 LC-MS detection chromatogram of the degradation product of zearalenone by Tibet R.mucilaginosa

圖3 玉米赤霉烯酮LC/MC檢測(cè)質(zhì)譜圖Fig.3 LC/MC detection mass spectrum of zearalenone

圖4 玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮LC-MS檢測(cè)質(zhì)譜圖Fig.4 LC-MS detection mass spectrum of zearalenol and zearalenone

2.5 膠紅酵母脅迫耐受能力研究

西藏膠紅酵母對(duì)脅迫的耐受特性是其影響生物清除法穩(wěn)定性的關(guān)鍵。如表4所示，西藏膠紅酵母與實(shí)驗(yàn)室普通釀酒酵母XZ-9和XZ-10相比，在10和20 mmol/L的低濃度氧化脅迫條件下具有較好的脅迫耐受能力；同時(shí)，經(jīng)–80 ℃下快速低溫脅迫后，膠紅酵母的活菌菌落數(shù)顯著高于XZ9和 XZ10（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，西藏膠紅酵母具有較好的環(huán)境脅迫耐受能力，降低細(xì)胞損傷和凋亡的速率，提高酵母胞內(nèi)物質(zhì)活性對(duì)ZEN的吸附作用，具有較好的清除效果。

表4 膠紅酵母對(duì)氧化脅迫的耐受能力Table 4 The tolerance of R.mucilaginosa to oxidative stress

圖5 膠紅酵母對(duì)低溫脅迫的耐受能力Fig.5 The tolerance of R.mucilaginosa to low temperature stress

3 結(jié)論

通過(guò)研究西藏酵母對(duì)玉米赤霉烯酮的清除效果，發(fā)現(xiàn)西藏膠紅酵母對(duì)ZEN具有較好的清除能力，具體作用規(guī)律如下：（1）西藏膠紅酵母對(duì)ZEN的清除機(jī)制主要為吸附作用，同時(shí)該酵母在吸附ZEN后存在一定的胞內(nèi)降解作用；（2）西藏膠紅酵母與實(shí)驗(yàn)室普通酵母相比，對(duì)氧化脅迫和低溫脅迫具有較好的耐受能力，可作為克服真菌毒素生物清除缺陷的潛在菌種。

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