吳湘香，李云峰，楊傳順，杜開開，茹輝軍，張 燕，柳 凌，倪朝輝

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223)

自然水域具有開放屬性，水體中的氣體處于動(dòng)態(tài)平衡中，當(dāng)環(huán)境條件發(fā)生改變時(shí)，氣體在水體中的溶解度會(huì)發(fā)生改變，當(dāng)進(jìn)入水體中的氣體超過水體的溶解度時(shí)，水體中的氣體處于逸散狀態(tài)，即發(fā)生總?cè)芙鈿怏w(TDG)過飽和[1,2]。TDG過飽和現(xiàn)象既有自然發(fā)生的，也有人類活動(dòng)造成的[3]。大壩泄水導(dǎo)致下游河道發(fā)生過飽和，最早可追溯到20世紀(jì)初美國馬薩諸州的伍茲霍爾斯?jié)O業(yè)局的Gorham[4-5]和Marsh等[6]的研究，最著名、影響最廣泛則是20世紀(jì)60年代美國哥倫比亞河流域大壩下泄水導(dǎo)致河道TDG過飽和造成大規(guī)模的魚類死亡事件[3]。2003年6月，我國三峽水庫蓄水泄洪后，其下游長達(dá)482公里河道內(nèi)發(fā)生TDG過飽和，導(dǎo)致魚類死亡[7]。2013年5-7月，金沙江溪洛渡水電站機(jī)組試運(yùn)行，泄洪孔泄流導(dǎo)致向家壩庫區(qū)發(fā)生TDG過飽和，原位觀測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，暴露TDG過飽和水體中的胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)血液酸堿失衡誘發(fā)酸中毒[8]。

當(dāng)水體發(fā)生TDG過飽和時(shí)，魚類以及其他水生生物處于環(huán)境應(yīng)激狀態(tài)中，機(jī)體免疫力下降，導(dǎo)致疾病發(fā)生甚至死亡[9]。TDG過飽和水體導(dǎo)致魚類死亡的原因，一般認(rèn)為發(fā)病魚類循環(huán)系統(tǒng)中的氣泡阻塞是導(dǎo)致魚類死亡的主要原因[10]，也有研究認(rèn)為氣泡作為外源性物質(zhì)所引起的生化反應(yīng)以及繼發(fā)感染可能是造成魚類最終死亡的原因[11]。但以上推測(cè)主要基于解剖學(xué)觀察結(jié)果，關(guān)于魚類在TDG過飽和水體中的血液生理指標(biāo)變動(dòng)規(guī)律未見相關(guān)研究。

中華倒刺鲃(Spinibarbussinensis)，俗稱烏鱗、青波，隸屬鯉形目鯉科鲃亞科倒刺鲃屬，主要分布于我國長江上游及其支流，為長江上游淡水土著特有魚類[12]。本研究選擇中華倒刺鲃作為研究對(duì)象開展實(shí)驗(yàn)，探討TDG過飽和脅迫對(duì)魚類血液生理指標(biāo)的影響，以期為TDG過飽和導(dǎo)致魚類發(fā)病的機(jī)理問題解析提供數(shù)據(jù)支持和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 TDG過飽和水的制備

實(shí)驗(yàn)用TDG過飽和水來自于自行研制的過飽和發(fā)生裝置，如圖1所示，主要由進(jìn)水管、壓力容器罐和出水管三部分構(gòu)成。壓力容器罐高3 m，直徑1.2 m，空壓機(jī)功率2.2 kW，排氣量280 L/min。

空氣經(jīng)過空壓機(jī)壓縮后，注入壓力容器灌中，進(jìn)水經(jīng)過壓力容器罐頂端文丘里管后，與壓縮空氣混合，罐壓為0.2 MPa，水氣混合15 min左右，進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)后，采用便攜式溶氧儀(美國HACH，HQ30D)測(cè)試實(shí)驗(yàn)用水的溶解氧飽和度，實(shí)驗(yàn)過程中出水口的溶解氧飽和度平均值控制在(165±2)%。

圖1 TDG過飽和水發(fā)生裝置Fig.1 The System diagram of total dissolved gas supersaturation water-generating

1.2 實(shí)驗(yàn)魚來源及暫養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)魚來自四川省水產(chǎn)研究所，低溫充氧空運(yùn)至長江水產(chǎn)研究所湖北荊州窯灣試驗(yàn)場(chǎng)。實(shí)驗(yàn)魚規(guī)格為平均體長(22.47±0.70)cm，平均體重(267.48±33.93)g。實(shí)驗(yàn)魚先進(jìn)行一周暫養(yǎng)，暫養(yǎng)池為圓形水泥池，直徑2.40 m，最大水深75 cm，暫養(yǎng)水溫為20.3～22.7 ℃，溶氧為6.37～7.48 mg/L，pH為7.13～7.87，空氣大氣壓平均值為1 005 hPa。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)TDG過飽和組和1個(gè)對(duì)照組，TDG過飽和組由加壓水與未加壓的水體按照一定比例混合配制而成，分別為G1、G2、G3和G4組，各實(shí)驗(yàn)組溶解氧飽和度見表1。每組設(shè)3個(gè)平行組，每個(gè)平行組5尾魚。實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溶解氧濃度，通過調(diào)節(jié)加壓水流量來維持各實(shí)驗(yàn)組的飽和度。

1.4 樣品采集及處理

表1 實(shí)驗(yàn)分組情況Tab.1 The design of groups in this experiment

血液采集采用1 mL塑料注射器，從背動(dòng)脈穿刺采集全血進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。為避免血液在檢測(cè)過程中凝血，采血前注射器的針頭用肝素鈉溶液潤洗。

每尾實(shí)驗(yàn)魚的血液樣品采集完后，記錄下實(shí)驗(yàn)魚從入水到采集血液的時(shí)間，并對(duì)實(shí)驗(yàn)魚的外觀進(jìn)行描述性評(píng)估和記錄。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用X±SD記錄，數(shù)據(jù)處理在軟件EXCEL2016和SPSS16.0中分析完成。采用Duncan多重比較進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表示組間差異顯著，P<0.01表示組間差異極顯著，P>0.05表示組間差異不顯著。

2 結(jié)果分析

2.1 時(shí)間耐受

G1、G2、G3、G4組魚類分別在過飽和水中暴露15、10、4.25、5 h后，身體失去平衡和自主游泳能力。如圖2所示，G1和G2組、G3和G4之間的差異不顯著，G1和G3、G2和G3差異極顯著，G1和G4、G2和G4差異顯著，隨著TDG飽和度升高，中華倒刺鲃的耐受時(shí)間明顯縮短，且發(fā)病時(shí)間相對(duì)集中。

2.2 體表特征

G1、G2組的實(shí)驗(yàn)魚體表出現(xiàn)氣泡、鰭條充血等典型氣泡病特征，而G3、G4組的實(shí)驗(yàn)魚在實(shí)驗(yàn)過程中，氣泡病癥狀較不明顯，具體見表2。

圖2 中華倒刺鲃對(duì)不同飽和度水體的時(shí)間耐受差異Fig.2 Time tolerance of S.sinensis to the different levels supersaturated water

表2 各組實(shí)驗(yàn)魚體表特征Tab.2 The body characteristics in the different groups

2.3 血液生理指標(biāo)的變動(dòng)情況

2.3.1 血液酸堿度

2.3.2 血液葡萄糖的變化

由圖3可知，暴露在TDG過飽和水體中的中華倒刺鲃Glu水平較對(duì)照組均極顯著升高，各個(gè)濃度的TDG過飽和脅迫都導(dǎo)致魚類血液血糖升高，而TDG過飽和G1、G2、G3、G4組的組間差異不顯著。

2.3.3 血液紅細(xì)胞壓積和血紅蛋白的變化

由表4可知，暴露在TDG過飽和G1、G2、G3、G4組和對(duì)照組間中華倒刺鲃Hb和Hct水平均無顯著差異。

2.3.4 血液離子濃度變化

由表5可知，暴露在TDG過飽和水體中的中華倒刺鲃血液Na+和Cl-離子濃度較對(duì)照組差異不顯著，暴露TDG過飽和水體中的中華倒刺鲃血液K+離子濃度較對(duì)照組升高，對(duì)照組和G1組差異顯著，而與G2、G3和G4之間差異均不顯著。

表3 各組中華倒刺鲃血液和pCO2含量Tab.3 Blood contents of and pCO2 in the different groups

圖3 各組中華倒刺鲃血液Glu含量Fig.3 Blood content of Glu in the different groups

表4 各組中華倒刺鲃血液Hb和Hct含量Tab.4 Blood contents of Hb and Hct in the different groups

表5 各組中華倒刺鲃血液Na+，Cl-和K+ 濃度Tab.5 Levels of Na+，Cl-and K+ of blood in the different groups mmol/L

3 討論

3.1 TDG飽和度對(duì)魚類的影響

水體氣體過飽和會(huì)導(dǎo)致魚類發(fā)生氣泡病，在不同飽和水平的水體中，氣泡病發(fā)病進(jìn)程存在差異，在TDG飽和度達(dá)到125%和130%的水體中，魚類死亡時(shí)體表并沒有明顯的氣泡病癥狀，而在115%飽和水體中，魚類死亡時(shí)體表氣泡病癥狀最為明顯[13]。本研究中華倒刺鲃在不同飽和度的水體中耐受時(shí)間、行為表現(xiàn)和體表外觀，均存在較大差異。低飽和度組(G1組、G2組)和高飽和度組(G3組、G4組)之間的魚類耐受時(shí)間差異顯著，高飽和度組魚體失去平衡的發(fā)生時(shí)間集中，而低飽和度組魚體失去平衡的發(fā)生時(shí)間范圍大，推測(cè)TDG過飽和高飽和度組中魚類通氣量過大，無法調(diào)節(jié)機(jī)體去適應(yīng)環(huán)境的改變，因而短時(shí)間集中死亡，體表較少出現(xiàn)典型氣泡病癥狀，而在低飽和度水體中，魚體在調(diào)節(jié)機(jī)體適應(yīng)環(huán)境條件的改變過程中表現(xiàn)出典型氣泡病癥狀。

3.2 TDG過飽和對(duì)魚類血液酸堿平衡的影響

本實(shí)驗(yàn)中TDG過飽和暴露組中華倒刺鲃血液pCO2和TCO2顯著高于對(duì)照組，推測(cè)在分壓差的作用下，CO2進(jìn)入紅細(xì)胞，在碳酸酐酶的催化作用下解離成氫離子和碳酸氫根離子，紅細(xì)胞中H·Hb-K·KHbO2緩沖對(duì)中和氫離子成為H·HbO2和K+，最終導(dǎo)致暴露TDG過飽和水體中的中華倒刺鲃血液K+濃度較對(duì)照組升高。

3.3 TDG過飽和對(duì)魚類血糖的影響

血糖作為機(jī)體的主要功能物質(zhì)，一般在機(jī)體內(nèi)的血糖含量維持在相對(duì)穩(wěn)定的水平，以維系生命各系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。研究表明，魚類在應(yīng)激狀態(tài)下，血糖水平會(huì)升高[18-19]，推測(cè)可能與環(huán)境壓力下的魚類血液循環(huán)中的兒茶酚胺含量增加有關(guān)[16]。魚類以及其他水生生生物處于環(huán)境應(yīng)激狀態(tài)中，會(huì)產(chǎn)生一系列的應(yīng)激反應(yīng)，包括神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)(初級(jí)應(yīng)激反應(yīng))和代謝與機(jī)能的改變(次級(jí)應(yīng)激反應(yīng))，在次級(jí)應(yīng)激反應(yīng)階段，血液中的葡萄糖、乳酸濃度等會(huì)發(fā)生變化[14]。本研究結(jié)果中，暴露在TDG過飽和水體中的魚類血糖水平較對(duì)照組發(fā)生顯著升高，提示TDG過飽和對(duì)魚體產(chǎn)生脅迫效應(yīng)，暴露在其中的魚類處于環(huán)境應(yīng)激狀態(tài)。

4 小結(jié)

綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示中華倒刺鲃在TDG過飽和脅迫導(dǎo)致魚體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，在適應(yīng)環(huán)境變化過程中，血液酸堿平衡失調(diào)，機(jī)體發(fā)生酸中毒。