凌 晨，張美東，沙 航，鄒桂偉，羅相忠，梁宏偉

(1.水產(chǎn)科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué))，上海 201306； 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223； 3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(上海海洋大學(xué))，上海 201306)

溶解氧(dissolved oxygen，DO)是影響魚類生存和生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因子。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中影響水體溶解氧的因素有光照[1]、水溫[2]等。水體中溶解氧水平過高或過低均會(huì)引起魚體發(fā)生強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)從而導(dǎo)致其氧化抗氧化平衡發(fā)生改變[3]，過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)是生物體中三種主要的抗氧化酶，也是反映魚體健康與否的重要指標(biāo)，其組成的抗氧化系統(tǒng)用來抵御低氧脅迫過程中產(chǎn)生的多余氧自由基。西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)在低氧脅迫下肝臟CAT和SOD酶活顯著降低[4]；大口黑鱸(Micropterussalmoides)受低氧脅迫時(shí)其肝臟的 CAT和GPX活性明顯升高[5]；在卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)[6]、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[7]、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[8]中均發(fā)現(xiàn)低氧脅迫能誘導(dǎo)抗氧化酶活性發(fā)生變化。

鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)，俗稱白鰱，屬鯉科鰱屬，2019年全國養(yǎng)殖總產(chǎn)量達(dá)381.03萬噸，僅次于草魚[9]，是我國重要的大宗淡水養(yǎng)殖魚類之一，也是長(zhǎng)江增殖放流的主要魚類[10]。由于鰱性情急躁，應(yīng)激刺激后反應(yīng)強(qiáng)烈，易出現(xiàn)浮頭，泛塘現(xiàn)象，是一種極不耐低氧的魚類，在高密度運(yùn)輸、氣溫驟變過程中非常容易引起低氧應(yīng)激、死亡等現(xiàn)象，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)鰱低氧相關(guān)的研究主要集中在低氧相關(guān)基因的cDNA克隆與表達(dá)變化分析等方面[11-13]，僅見胡利雙[14]對(duì)低氧脅迫下鰱組織氧化應(yīng)激指標(biāo)進(jìn)行了研究。本試驗(yàn)從酶活性和基因表達(dá)水平分析低氧脅迫對(duì)鰱應(yīng)激的生理響應(yīng)過程，研究了鰱對(duì)溶氧變化的適應(yīng)性調(diào)節(jié)機(jī)制，為其健康養(yǎng)殖及耐低氧品種選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚來源

試驗(yàn)用鰱取自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部鰱遺傳育種中心，體長(zhǎng)為(22.1±0.8) cm，體重為(200±12.4) g，在選育車間的玻璃缸中暫養(yǎng)一周后，挑選外觀健康，活力正常，規(guī)格相對(duì)一致的個(gè)體用于試驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集

將暫養(yǎng)后的鰱隨機(jī)分為4組(常氧組和3個(gè)低氧脅迫實(shí)驗(yàn)組)，分別放入80 L的透明水箱中，每組設(shè)3個(gè)平行，每箱放入10尾，總計(jì)120尾，實(shí)驗(yàn)水溫維持在(23.0±0.53) ℃。常氧組鰱保持正常溶氧[T0，DO值為(6.42±0.3) mg/L]，試驗(yàn)組用保鮮膜和塑料蓋密封，試驗(yàn)期間用溶氧儀測(cè)定各試驗(yàn)組水中溶氧量。其中常氧組在低氧脅迫前進(jìn)行采樣；浮頭組[T1，DO值為(0.76±0.03) mg/L]在試驗(yàn)魚全部浮頭時(shí)采樣；半窒息組[T2，DO值為(0.58±0.06) mg/L]在缸內(nèi)半數(shù)魚死亡時(shí)，采未死亡試驗(yàn)魚作為樣本；窒息組[T3，DO值為(0.27±0.06) mg/L]在試驗(yàn)魚全部死亡時(shí)采樣。每組隨機(jī)采5尾，采樣前用150 mg/L的MS-222麻醉試驗(yàn)魚以降低應(yīng)激反應(yīng)，然后用一次性滅菌注射器在尾椎靜脈采血，放入離心管中，混勻，4 ℃下血液經(jīng)3 500 r/min離心10 min，吸取上清液制備血清，所得血清為無色或是淡黃色，將血清放于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采血后迅速解剖魚體，取出鰓、肝臟等組織用干凈無菌的凍存管裝樣本，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 酶液制備

取采樣時(shí)所得的血液上清待測(cè)，并稱取凍存的肝臟組織0.5 g左右，按照重量體積比為1∶9的比例加入9倍體積的預(yù)冷生理鹽水(0.86%)，用全自動(dòng)組織破碎儀制備10%的組織勻漿，冰水浴條件下，2 500 r/min離心10 min，所得上清液用于SOD、CAT和GPX活性的測(cè)定，所有樣品在12 h內(nèi)測(cè)定完畢。

1.4 酶活性測(cè)定方法

酶活均使用南京建成生物有限公司試劑盒進(jìn)行測(cè)定。SOD活性用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定，其定義為1 mg組織蛋白(1 mL血清)在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)酶活力單位。CAT活性采用鉬酸銨顯色測(cè)定法，其定義為1 mg組織蛋白(1 mL血清)1 s分解1 mol的過氧化氫(H2O2)的量為1個(gè)酶活力單位。GPX活性采用DTNB直接法測(cè)定，其定義為1 mg組織蛋白(0.1 mL血清)在37 ℃反應(yīng)5 min，扣除非酶反應(yīng)的作用，使反映體系中GSH濃度降低1 mol/L為一個(gè)酶活力單位。

1.5 總RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

取0.1 g鰱肝臟、鰓組織按照Trizol法提取總RNA，用超微量分光光度計(jì)NP80(德國，IMPLEN) 測(cè)定RNA在260～280 nm下吸光光度比值(OD260 nm/OD280 nm) 檢測(cè)RNA的質(zhì)量、純度以及濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。使用HiScript cDNA Synthesis Kit試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用本課題已發(fā)表的Mn-SOD、Cu/Zn-SOD基因引物序列，以β-actin為內(nèi)參基因(表1)，由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL：2 × ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板0.8 μL，ddH2O 8.4 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 32 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s。以2-ΔΔCt法換算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增引物序列Tab.1 Primer sequences used in the real-time fluorescence quantitative PCR

1.6 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013和SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理，并以SPSS 22.0分別進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan’s多重比較。

2 結(jié)果

2.1 低氧脅迫對(duì)鰱血清抗氧化酶活性的影響

隨著氧濃度的降低，鰱血清CAT酶活性呈現(xiàn)出先升高后降低的變化，在半窒息時(shí)CAT酶活力達(dá)到最大(12.84±0.56) U/mL，顯著高于正常溶氧、浮頭和窒息時(shí)的酶活力(P<0.05)，窒息點(diǎn)時(shí)酶活降至最低(圖1)；低氧脅迫過程中，血清中的SOD酶活在浮頭至窒息的過程中先升高后降低，浮頭時(shí)酶活相比于常氧組顯著降低，半窒息點(diǎn)時(shí)SOD又顯著升高隨后降至最低(51.2±1.24) U/mL，與其它各點(diǎn)均具有顯著性差異(圖1)；GPX酶活力在整個(gè)低氧脅迫過程中呈先升高后降低的趨勢(shì)，但均高于正常溶氧，且在浮頭時(shí)GPX酶活力達(dá)到最大值(248.35±28.36) U/mL，隨后一直降低，在整個(gè)過程中無顯著差異(P>0.05)。

圖1 低氧脅迫下鰱血清酶活性的變化Fig.1 Changes of serum enzyme activity under hypoxia stress in H.molitrix T0表示常氧組，T1表示浮頭組，T2表示半窒息組，T3表示窒息組。柱上標(biāo)不同小寫字母 表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

2.2 低氧脅迫對(duì)鰱肝臟組織抗氧化酶活性的影響

隨著氧濃度的降低，鰱肝臟SOD、CAT、GPX 3種酶活力均呈先升高后降低的變化趨勢(shì)(圖2)。CAT在低氧脅迫至浮頭時(shí)，酶活力升高且達(dá)到最大值(43.61±1.79) U/mg，相比于常氧組無明顯變化，隨著溶解氧的降低，CAT酶活力一直呈降低的趨勢(shì)，到窒息時(shí)降至最低(29.31±4.30) U/mg，顯著低于正常溶氧、浮頭和半窒息時(shí)的酶活力。SOD在低氧脅迫過程中活力先升高后降低，在浮頭時(shí)酶活力達(dá)到最大(87.57±2.91) U/mg，與常氧相比無明顯差異，隨后一直呈下降趨勢(shì)，窒息時(shí)顯著低于其它各點(diǎn)的酶活力；GPX酶活力在低氧脅迫過程中先上升后下降，半窒息時(shí)達(dá)到最大值(132.92±44.62) U/mg，隨后在窒息組時(shí)降低至(102.15±36.69) U/mg，與其他各點(diǎn)的酶活均無顯著差異。

圖2 低氧脅迫下鰱肝臟酶活性的變化Fig.2 Changes of liver enzyme activity under hypoxia stress in H.molitrix

2.3 低氧脅迫對(duì)超氧化物歧化酶基因(SODs)表達(dá)的影響

在肝臟中，Cu/Zn-SOD基因在整個(gè)低氧脅迫過程中的相對(duì)表達(dá)量呈先升高再降低的變化趨勢(shì)，在浮頭時(shí)Cu/Zn-SOD相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高，隨后一直呈下降趨勢(shì)，在窒息時(shí)顯著低于常氧組。Mn-SOD基因在浮頭時(shí)表達(dá)量升高，之后在半窒息時(shí)顯著低于常氧組，窒息時(shí)Mn-SOD基因的表達(dá)量又出現(xiàn)升高，相較于常氧組無顯著性差異(圖3)。在鰓中，Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因在常氧組時(shí)表達(dá)量最高，隨著氧濃度的降低，Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因在浮頭時(shí)的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低，半窒息時(shí)Cu/Zn-SOD基因的表達(dá)量顯著上升后在窒息時(shí)下降，與其它各點(diǎn)相比均有顯著性差異。Mn-SOD基因的相對(duì)表達(dá)量從浮頭到窒息一直呈下調(diào)趨勢(shì)，與常氧組相比均具有顯著性差異。

圖3 低氧脅迫對(duì)鰱肝臟和鰓中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of hypoxia stress on the relative expression of Cu/Zn-SOD、Mn-SOD gene in liver and gill of H.molitrix

3 討論

3.1 鰱血清和肝臟組織中抗氧化酶活力在低氧脅迫下的變化

在低氧脅迫初期(浮頭)，鰱血清CAT和GPX酶活力上升，SOD酶活力顯著下降，此時(shí)已經(jīng)開始引起氧化應(yīng)激，機(jī)體開始產(chǎn)生抗氧化反應(yīng)。隨著氧濃度的降低，在半窒息時(shí)SOD 和CAT酶活力顯著上升，GPX酶活力下降，此時(shí)由于低氧脅迫導(dǎo)致魚體內(nèi)產(chǎn)生大量的氧自由基，CAT和SOD活力升高以清除這些氧自由基，從而保護(hù)體內(nèi)細(xì)胞免受損傷；窒息時(shí)CAT、SOD和GPX酶活力都發(fā)生下降，與張勇等[15]在美洲鰣(Alosasapidissima)中的研究結(jié)果一致，表明氧濃度過低會(huì)影響鰱抗氧化系統(tǒng)的功能，降低其抗氧化能力并破壞體內(nèi)原有的自由基代謝平衡，產(chǎn)生氧化損傷，使機(jī)體細(xì)胞的正常生理功能被破壞，最終導(dǎo)致試驗(yàn)魚死亡。肝臟中，在整個(gè)低氧脅迫過程中CAT、SOD酶活力整體呈下降趨勢(shì)，GPX呈上升的趨勢(shì)。張志偉[16]也發(fā)現(xiàn)在鰱肝臟中低氧可抑制SOD的產(chǎn)生，但在鰓中的結(jié)果相反。浮頭時(shí)CAT、SOD和GPX出現(xiàn)升高，表明低氧水平可誘導(dǎo)抗氧化酶活性的升高，以清除多余的氧自由基，從而降低氧化應(yīng)激造成的危害，與卵形鯧鲹[17]、青田田魚(Cyprinuscarpiovar.qingtianensis)[18]的研究結(jié)果相吻合。隨著氧濃度的降低，肝臟中CAT、SOD酶活力在窒息點(diǎn)時(shí)顯著降低，GPX酶活力降至與正常組幾乎持平，與團(tuán)頭魴[19]、西伯利亞鱘[20]在低氧脅迫后結(jié)果相類似，以往研究發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境下大頭兔脂鯉(Leporinusmacrocephalus)[21]肝胰臟中SOD活性和CAT活性顯著降低；細(xì)鱗肥脂鯉(Piaractusmesopotamicus)[22]和葛氏鱸塘鱧(Perccottusglenii)[23]在低氧脅迫下肝胰臟CAT活性和GPX活性也顯著降低，與本研究結(jié)果相似。窒息點(diǎn)的溶氧量太低導(dǎo)致魚體的肝臟功能受到影響，難以通過提高自身抗氧化酶活力來清除體內(nèi)過量活性氧分子，最終致使魚體死亡。本研究中鰱血清和肝臟在氧濃度持續(xù)降低過程中，表現(xiàn)出不同的抗氧化響應(yīng)模式，這與陳世喜[6]的研究結(jié)果類似。

3.2 低氧脅迫對(duì)超氧化物歧化酶基因表達(dá)的影響

本研究中Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因在肝臟和鰓組織都有表達(dá)，是由于Cu/Zn-SOD和Mn-SOD可以在各種功能細(xì)胞中發(fā)揮作用[24]，然而兩個(gè)基因在肝臟和鰓組織中的表達(dá)方式卻不同。在低氧脅迫過程中Cu/Zn-SOD和Mn-SOD在肝臟大量表達(dá)，而在鰓中表達(dá)量相對(duì)較低，說明肝臟對(duì)于低氧脅迫的影響要比鰓更為敏感，這可能與不同組織執(zhí)行的生理功能不同有關(guān)。肝臟作為一種重要的免疫組織，是排毒和體外生物代謝的重要器官，能夠維持魚類的穩(wěn)定狀態(tài)和正常生理功能。在肝臟中，Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的mRNA表達(dá)水平在浮頭時(shí)均升高，隨著氧濃度的降低Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的表達(dá)水平受到抑制，與SOD酶活力的變化趨勢(shì)相一致。浮頭時(shí)Cu/Zn-SOD和Mn-SOD表達(dá)量的升高，超氧化物歧化酶活力也升高，表明SOD酶系統(tǒng)的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)在很短的時(shí)間內(nèi)就會(huì)被激活。此時(shí)低氧脅迫誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS增加，SOD抗氧化酶系統(tǒng)則需要增加表達(dá)水平來維持細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激平衡狀態(tài)[25]。董國凱[26]在大鼠的研究中認(rèn)為，氧自由基本身可以發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，過量生成或SOD活性下降有可能觸發(fā)細(xì)胞的內(nèi)在代償調(diào)節(jié)機(jī)制，激活胞漿中的基因調(diào)控蛋白，使Cu/Zn-SODmRNA相對(duì)表達(dá)量增加。在低氧脅迫后期，肝臟中SODs mRNA表達(dá)的被抑制，導(dǎo)致肝臟細(xì)胞中ROS的大量積累，細(xì)胞內(nèi)氧化平衡狀態(tài)被打破，從而加速了肝細(xì)胞功能的紊亂甚至喪失。鰓作為魚類的主要呼吸器官，在進(jìn)行新陳代謝和滲透壓調(diào)節(jié)等方面具有重要的功能，同時(shí)由于鰓直接暴露于外部環(huán)境中，因此是對(duì)外界刺激最敏感的器官。在鰱鰓組織中，隨著低氧脅迫的進(jìn)行，Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的mRNA表達(dá)水平在浮頭時(shí)均顯著降低而后持續(xù)低表達(dá)，低氧脅迫對(duì)鰓組織造成了一定的氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致其抗氧化系統(tǒng)紊亂，無法維持細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激平衡狀態(tài)。

4 結(jié)論

低氧脅迫對(duì)鰱不同組織中抗氧化酶及Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因表達(dá)均產(chǎn)生顯著影響。雖然鰱能通過自我調(diào)節(jié)抗氧化酶活力和上調(diào)SODs基因表達(dá)來抵御氧化應(yīng)激反應(yīng)，但在嚴(yán)重低氧脅迫下，氧化壓力超過了機(jī)體組織的抗氧化調(diào)節(jié)能力，魚體內(nèi)環(huán)境遭到破壞，組織發(fā)生損傷，自身的抗氧化防御機(jī)制受到影響，最終導(dǎo)致機(jī)體免疫能力降低，甚至出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。