楊培奎，林 敏，張振霞，查廣才，鄭玉忠

(韓山師范學院生命科學與食品工程學院，廣東潮州 521041)

目前，水產(chǎn)疾病的發(fā)生和流行已嚴重威脅到軟體動物、魚類、蝦等的規(guī)?；B(yǎng)殖[1]。其中由嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)等引起的細菌性病害是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)面臨的嚴重威脅之一[2-5]。面對水產(chǎn)動物疾病頻發(fā)的情況，一些水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)大量使用或不規(guī)范使用抗生素，使得細菌耐藥性頻繁發(fā)生，加重了水產(chǎn)疾病防治的困難。這不僅危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，而且也威脅到人類的健康，因此尋求抗生素替代品是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要方向[3]。許多中藥具有抗病毒、抗菌活性和增強免疫的特點，且來源廣泛、價格低廉，毒性低，不易產(chǎn)生耐藥性等。因此，在當前限制使用抗生素的形勢下，使用中藥提取物替代傳統(tǒng)抗生素是水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害防控的發(fā)展趨勢之一。本試驗以嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌為致病菌的代表，進行體外抑菌試驗篩選有效的中藥抗菌藥物，旨在為中藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控中的使用提供指導。

1 材料和方法

1.1 供試材料

所有中藥材均購自康美藥業(yè)有限公司，經(jīng)珠海國家中醫(yī)藥現(xiàn)代化工程研究中心鑒定。為防止?jié)駳夂拖x蛀，將中藥材保存于4 ℃的干燥密封容器中。本研究選用測試菌株嗜水氣單胞菌(NBRC 12658)、副溶血弧菌(ATCC 17802)和溶藻弧菌(ATCC 33787)均為汕頭大學謝麗玲教授惠贈。

1.2 方法

1.2.1 中藥藥液的制備

稱取中藥25 g加入500 mL蒸餾水中，浸泡30 min，煮沸1 h，用紗布過濾，收集濾液，文火煎熬濃縮至25 mL相當于生藥的質(zhì)量濃度為1 g/mL；隨后將濾液1 000 r/min離心10 min，收集上層濾液并用0.22 μm濾膜過濾；將濾液分裝，取出一部分用于藥液干物質(zhì)質(zhì)量測定，其余保存于-80 ℃?zhèn)溆?。本研究所用中藥及其提取液干物質(zhì)質(zhì)量濃度如表1所示。

表1 試驗中草藥及其提取液質(zhì)量濃度Tab.1 Tested Chinese herbal medicines and extracts matter concentration mg/mL

1.2.2 體外抑菌活性測定

采用圓盤擴散法測定所有中藥提取物的抑菌活性。取少量保種菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，并在30 ℃，150 r/min恒溫搖床中培養(yǎng)18 h。接著，吸取 1 mL 菌液于1.5 mL 離心管中，6 000 r/min離心2 min，棄去上清，用無菌生理鹽水稀釋菌體至 1×107CFU/mL，取100 μL細菌懸濁液涂于LB固體培養(yǎng)基上。隨后，在LB固體培養(yǎng)基上放置直徑為6 mm的滅菌濾紙，并用20 μL的中藥提取液浸潤。將培養(yǎng)皿置于30 ℃培養(yǎng)24 h，隨后測定抑菌圈直徑。以恩諾沙星(Sigma,20 μL,0.1 mg/mL)為陽性對照，以20 μL蒸餾水為陰性對照。所有的分析都進行了三次。計算平均值，進行對比研究，根據(jù)抑菌圈直徑大小判定其抑菌能力的強弱。

1.2.3 測定最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)值

用肉湯微量稀釋法測定中藥提取物對供試菌株的MIC和 MBC。首先，準備12個無菌離心管，在第一個離心管中加入500 μL的中藥提取物并與1.5 mL的LB液體培養(yǎng)基混合。隨后，吸取1 mL以1∶1(1 mL的稀釋中藥提取液：1 mL的LB液體培養(yǎng)基)依次稀釋到第2～11管，第12管作為空白對照。每管接種(20 μL)菌懸液(1×106CFU/mL)，所有試管30 ℃孵育24 h。 孵育后，每個試管中加入5 μL MTT(Sigma,5 mg/mL)溶液，30 ℃孵育30 min[6,7]。在有大量活菌存在的離心管中，黃色MTT染料被還原為藍色，因此將培養(yǎng)基顏色未發(fā)生變化的最小藥物濃度定為MIC，分析重復三次。從判定為MIC的離心管及高一級藥物濃度的離心管中分別取部分液體培養(yǎng)基涂布于LB營養(yǎng)瓊脂板上，30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察是否有菌落。未長出菌落的試管的最小藥物濃度即為MBC，分析重復三次。

1.2.4 棋盤格法測定中藥組合效果

依據(jù)朱利霞等[8]和龍繼兵等[9]的方法，采用微量肉湯棋盤稀釋法測定丁香、山茱萸、五味子、羅漢果、八角等5種中藥兩兩組合后的體外抑菌的聯(lián)用抑菌指數(shù)(FIC)。根據(jù)體外抑菌試驗結果，選擇5種體外抑菌效果敏感藥物兩兩組合按照1∶1的比例進行配比，并測定聯(lián)用抑菌指數(shù)(FIC)。

FIC(聯(lián)用抑菌指數(shù))的計算方法[8,9]如下：

∑FIC=FICA+FICB

式中FICA為A藥聯(lián)用時MIC值/A藥單用時的MIC,FICB為B藥聯(lián)用時MIC值/B藥單用時的MIC。當FIC≤0.50時,為顯著協(xié)同作用；當0.50

2 結果

2.1 中藥體外抑菌圈測定結果

從抑菌結果可知(表2)，12種中藥提取液對3種供試致病菌均具有一定的抑制作用。其中，五味子、八角、羅漢果、山茱萸和丁香等對供試菌株的抑制作用明顯優(yōu)于其它中藥。在12種中藥中，五味子對嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌的抑制效果最好。另外，地黃提取物對副溶血弧菌和溶藻弧菌有抑制作用，對嗜水氣單胞菌無抑制作用，黃芩提取物對嗜水氣單胞菌和溶藻弧菌抑菌效果較弱，對副溶血弧菌抑菌效果較好。

2.2 單味中藥MIC與MBC值測定結果

對中藥提取液抑制嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌的MIC和MBC進行測定。結果表明，12種中藥水提取物對嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌均具有不同程度的抑菌或殺菌作用(表3)。12種中藥提取液的MIC值為0.043～18.594 mg/mL，MBC值均為0.043～37.188 mg/mL。12種供測試的中藥中，丁香、羅漢果、山茱萸、五味子和黃連等對供試菌株的抑制效果優(yōu)于其它中藥。其中，山茱萸對嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌的MIC分別為0.172、0.043、0.086 mg/mL， MBC分別為0.344、0.043、0.172 mg/mL,是所有供試中藥中最低的，顯示該中藥對上述3種病原菌具有良好的抑制作用。

表2 中藥提取物的抑菌活性Tab.2 Antibacterial activity of herbal extracts measured as zones of inhibition

表3 中藥提取物的MIC值和MBC值Tab.3 Minimum inhibitory concentration(MIC) and minimum bactericidal concentration(MBC) of extract against bacteria mg/mL

2.3 中藥提取物的聯(lián)合抑菌效果

在MIC和MBC分析的基礎之上綜合抑菌圈的測定結果，選取丁香、羅漢果、山茱萸、五味子和八角等五種中藥進行復方聯(lián)合抑菌分析，結果如表4所示。結果表明，10種不同的藥物組合對嗜水氣單胞菌的聯(lián)合抑菌作用均為顯著協(xié)同作用；而大部分藥物組合對副溶血弧菌的抑菌效果表現(xiàn)為無相關作用，僅五味子和八角對副溶血弧菌的組合效果表現(xiàn)為協(xié)同作用。另外，丁香和羅漢果對副溶血弧菌的組合效果表現(xiàn)為拮抗作用。10種中藥組合對溶藻弧菌的聯(lián)合抑菌效果均表現(xiàn)為協(xié)同作用。在上述測試的10種藥物聯(lián)合抑菌中，僅五味子和八角配伍組合對3種供試菌株的聯(lián)合抑菌效果表現(xiàn)為顯著協(xié)同作用或協(xié)同作用。

表4 中藥提取物的聯(lián)合抑菌效果Tab.4 Combination effects of herbal extracts for inhibiting bacteria

3 討論

中藥作為一種兼具經(jīng)濟型和廣譜型的抗菌劑，近年來被作為促生長劑[11]、免疫興奮劑[12]、抗菌藥物[13]、抗病毒藥物[14]、抗真菌藥物[15]、抗應激藥物[16]廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。中藥抑菌常見的機制為中藥有效成分通過與細菌細胞膜、細胞壁、酶等結合，導致細胞結構發(fā)生變化或者酶變性，以多靶點的方式抑制細菌的生長或殺死病原菌[17]。本研究發(fā)現(xiàn)在單藥的抑菌圈分析中，五味子同時對3株供試菌株的抑菌效果最明顯。類似的研究也表明，五味子是一種潛在廣譜抗菌藥，對多種病原菌如多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)、河流弧菌(Vibriofluvialis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)等具有較好的抑菌效果[18-21]。

進一步分析丁香、羅漢果、山茱萸、五味子和黃連等藥物對3種病原菌的MIC和MBC表明，山茱萸對3種病原菌的MIC和MBC值最低。山茱萸抑菌效果可能與其含有多種次生代謝物如馬錢苷、單寧(鞣酸)等酚類物質(zhì)以及酒石酸、蘋果酸和沒食子酸等有機酸有關[22]。有研究表明，酚類物質(zhì)可通過破壞膜完整性和膜蛋白、影響DNA和RNA的合成、破壞線粒體功能等多種模式發(fā)揮抗菌活性[23,24]。鞣酸等有機酸可與細菌鞭毛、菌體表面酶類等結合，影響病菌的運動能力或使水解酶等失活，導致病原菌因細胞結構破壞和代謝停滯而死亡[25]。Payne等[26]發(fā)現(xiàn)單寧可通過抑制細菌葡萄糖基轉移酶活性，從而抑制細菌生物膜的形成。雖然，本研究的結果表明12種中藥提取物大部分都能抑制或殺滅供試菌株的生長，但同一菌株對不同的中藥也表現(xiàn)出不同的敏感性。這可能與不同致病菌對不同中藥所含有效抗菌成分的敏感度不同有關，因此在實際使用中應根據(jù)病原菌的種類選擇合適的藥物。

中藥復方由多種藥物組成，合理的單味藥配伍組成復方可協(xié)同增效，抑菌效果比單味中藥更佳[27]。同時，不同藥物的配伍組方也有助于降低藥物劑量的使用，降低毒性和細菌耐藥性的出現(xiàn)[28,29]。多種中藥配伍使用產(chǎn)生的協(xié)同效應可能與多種中藥有效化學成分、多靶點、多途徑協(xié)同抑菌有關[30]。Pei等[31]的研究指出丁香油酚/香芹酚的協(xié)同作用可能與香芹酚瓦解桿菌外膜，使丁香油酚更容易進入細胞質(zhì)與蛋白質(zhì)結合有關。Zhou等[32]的研究表明百里香酚可增強細胞膜的通透性，從而使肉桂醛更容易進入細胞。中藥配伍產(chǎn)生拮抗減效可能與針對相關病原菌的有效成分在配伍組合中因相互結合、吸附等物理作用而降低有效成分的濃度，或者發(fā)生化學反應而失去原有的抗菌活性等因素有關。本研究中結果表明，不同中藥聯(lián)合使用對不同致病菌的抑制效果存在差異。其中，10種組合對嗜水氣單胞菌的抑菌效果均表現(xiàn)為顯著協(xié)同或協(xié)同作用，對溶藻弧菌的抑菌效果均表現(xiàn)為協(xié)同作用，對副溶血弧菌的抑菌效果則是無關甚至拮抗。這可能與副溶血弧菌對藥物敏感性的機制與嗜水氣單胞菌和溶藻弧菌存在顯著差異相關。因此，本研究中12種中藥及其組方對3種病原菌的有效抑菌成分以及抑菌機制還有待進一步研究。