楊培奎，林 敏，張振霞，查廣才，鄭玉忠

(韓山師范學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，廣東潮州 521041)

目前，水產(chǎn)疾病的發(fā)生和流行已嚴(yán)重威脅到軟體動(dòng)物、魚類、蝦等的規(guī)?；B(yǎng)殖[1]。其中由嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)等引起的細(xì)菌性病害是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)面臨的嚴(yán)重威脅之一[2-5]。面對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物疾病頻發(fā)的情況，一些水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)大量使用或不規(guī)范使用抗生素，使得細(xì)菌耐藥性頻繁發(fā)生，加重了水產(chǎn)疾病防治的困難。這不僅危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，而且也威脅到人類的健康，因此尋求抗生素替代品是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要方向[3]。許多中藥具有抗病毒、抗菌活性和增強(qiáng)免疫的特點(diǎn)，且來源廣泛、價(jià)格低廉，毒性低，不易產(chǎn)生耐藥性等。因此，在當(dāng)前限制使用抗生素的形勢(shì)下，使用中藥提取物替代傳統(tǒng)抗生素是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害防控的發(fā)展趨勢(shì)之一。本試驗(yàn)以嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌為致病菌的代表，進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)篩選有效的中藥抗菌藥物，旨在為中藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控中的使用提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

所有中藥材均購自康美藥業(yè)有限公司，經(jīng)珠海國(guó)家中醫(yī)藥現(xiàn)代化工程研究中心鑒定。為防止?jié)駳夂拖x蛀，將中藥材保存于4 ℃的干燥密封容器中。本研究選用測(cè)試菌株嗜水氣單胞菌(NBRC 12658)、副溶血弧菌(ATCC 17802)和溶藻弧菌(ATCC 33787)均為汕頭大學(xué)謝麗玲教授惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 中藥藥液的制備

稱取中藥25 g加入500 mL蒸餾水中，浸泡30 min，煮沸1 h，用紗布過濾，收集濾液，文火煎熬濃縮至25 mL相當(dāng)于生藥的質(zhì)量濃度為1 g/mL；隨后將濾液1 000 r/min離心10 min，收集上層濾液并用0.22 μm濾膜過濾；將濾液分裝，取出一部分用于藥液干物質(zhì)質(zhì)量測(cè)定，其余保存于-80 ℃?zhèn)溆?。本研究所用中藥及其提取液干物質(zhì)質(zhì)量濃度如表1所示。

表1 試驗(yàn)中草藥及其提取液質(zhì)量濃度Tab.1 Tested Chinese herbal medicines and extracts matter concentration mg/mL

1.2.2 體外抑菌活性測(cè)定

采用圓盤擴(kuò)散法測(cè)定所有中藥提取物的抑菌活性。取少量保種菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，并在30 ℃，150 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)18 h。接著，吸取 1 mL 菌液于1.5 mL 離心管中，6 000 r/min離心2 min，棄去上清，用無菌生理鹽水稀釋菌體至 1×107CFU/mL，取100 μL細(xì)菌懸濁液涂于LB固體培養(yǎng)基上。隨后，在LB固體培養(yǎng)基上放置直徑為6 mm的滅菌濾紙，并用20 μL的中藥提取液浸潤(rùn)。將培養(yǎng)皿置于30 ℃培養(yǎng)24 h，隨后測(cè)定抑菌圈直徑。以恩諾沙星(Sigma,20 μL,0.1 mg/mL)為陽性對(duì)照，以20 μL蒸餾水為陰性對(duì)照。所有的分析都進(jìn)行了三次。計(jì)算平均值，進(jìn)行對(duì)比研究，根據(jù)抑菌圈直徑大小判定其抑菌能力的強(qiáng)弱。

1.2.3 測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)值

用肉湯微量稀釋法測(cè)定中藥提取物對(duì)供試菌株的MIC和 MBC。首先，準(zhǔn)備12個(gè)無菌離心管，在第一個(gè)離心管中加入500 μL的中藥提取物并與1.5 mL的LB液體培養(yǎng)基混合。隨后，吸取1 mL以1∶1(1 mL的稀釋中藥提取液：1 mL的LB液體培養(yǎng)基)依次稀釋到第2～11管，第12管作為空白對(duì)照。每管接種(20 μL)菌懸液(1×106CFU/mL)，所有試管30 ℃孵育24 h。 孵育后，每個(gè)試管中加入5 μL MTT(Sigma,5 mg/mL)溶液，30 ℃孵育30 min[6,7]。在有大量活菌存在的離心管中，黃色MTT染料被還原為藍(lán)色，因此將培養(yǎng)基顏色未發(fā)生變化的最小藥物濃度定為MIC，分析重復(fù)三次。從判定為MIC的離心管及高一級(jí)藥物濃度的離心管中分別取部分液體培養(yǎng)基涂布于LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂板上，30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察是否有菌落。未長(zhǎng)出菌落的試管的最小藥物濃度即為MBC，分析重復(fù)三次。

1.2.4 棋盤格法測(cè)定中藥組合效果

依據(jù)朱利霞等[8]和龍繼兵等[9]的方法，采用微量肉湯棋盤稀釋法測(cè)定丁香、山茱萸、五味子、羅漢果、八角等5種中藥兩兩組合后的體外抑菌的聯(lián)用抑菌指數(shù)(FIC)。根據(jù)體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果，選擇5種體外抑菌效果敏感藥物兩兩組合按照1∶1的比例進(jìn)行配比，并測(cè)定聯(lián)用抑菌指數(shù)(FIC)。

FIC(聯(lián)用抑菌指數(shù))的計(jì)算方法[8,9]如下：

∑FIC=FICA+FICB

式中FICA為A藥聯(lián)用時(shí)MIC值/A藥單用時(shí)的MIC,FICB為B藥聯(lián)用時(shí)MIC值/B藥單用時(shí)的MIC。當(dāng)FIC≤0.50時(shí),為顯著協(xié)同作用；當(dāng)0.50

2 結(jié)果

2.1 中藥體外抑菌圈測(cè)定結(jié)果

從抑菌結(jié)果可知(表2)，12種中藥提取液對(duì)3種供試致病菌均具有一定的抑制作用。其中，五味子、八角、羅漢果、山茱萸和丁香等對(duì)供試菌株的抑制作用明顯優(yōu)于其它中藥。在12種中藥中，五味子對(duì)嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌的抑制效果最好。另外，地黃提取物對(duì)副溶血弧菌和溶藻弧菌有抑制作用，對(duì)嗜水氣單胞菌無抑制作用，黃芩提取物對(duì)嗜水氣單胞菌和溶藻弧菌抑菌效果較弱，對(duì)副溶血弧菌抑菌效果較好。

2.2 單味中藥MIC與MBC值測(cè)定結(jié)果

對(duì)中藥提取液抑制嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌的MIC和MBC進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，12種中藥水提取物對(duì)嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌均具有不同程度的抑菌或殺菌作用(表3)。12種中藥提取液的MIC值為0.043～18.594 mg/mL，MBC值均為0.043～37.188 mg/mL。12種供測(cè)試的中藥中，丁香、羅漢果、山茱萸、五味子和黃連等對(duì)供試菌株的抑制效果優(yōu)于其它中藥。其中，山茱萸對(duì)嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌的MIC分別為0.172、0.043、0.086 mg/mL， MBC分別為0.344、0.043、0.172 mg/mL,是所有供試中藥中最低的，顯示該中藥對(duì)上述3種病原菌具有良好的抑制作用。

表2 中藥提取物的抑菌活性Tab.2 Antibacterial activity of herbal extracts measured as zones of inhibition

表3 中藥提取物的MIC值和MBC值Tab.3 Minimum inhibitory concentration(MIC) and minimum bactericidal concentration(MBC) of extract against bacteria mg/mL

2.3 中藥提取物的聯(lián)合抑菌效果

在MIC和MBC分析的基礎(chǔ)之上綜合抑菌圈的測(cè)定結(jié)果，選取丁香、羅漢果、山茱萸、五味子和八角等五種中藥進(jìn)行復(fù)方聯(lián)合抑菌分析，結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，10種不同的藥物組合對(duì)嗜水氣單胞菌的聯(lián)合抑菌作用均為顯著協(xié)同作用；而大部分藥物組合對(duì)副溶血弧菌的抑菌效果表現(xiàn)為無相關(guān)作用，僅五味子和八角對(duì)副溶血弧菌的組合效果表現(xiàn)為協(xié)同作用。另外，丁香和羅漢果對(duì)副溶血弧菌的組合效果表現(xiàn)為拮抗作用。10種中藥組合對(duì)溶藻弧菌的聯(lián)合抑菌效果均表現(xiàn)為協(xié)同作用。在上述測(cè)試的10種藥物聯(lián)合抑菌中，僅五味子和八角配伍組合對(duì)3種供試菌株的聯(lián)合抑菌效果表現(xiàn)為顯著協(xié)同作用或協(xié)同作用。

表4 中藥提取物的聯(lián)合抑菌效果Tab.4 Combination effects of herbal extracts for inhibiting bacteria

3 討論

中藥作為一種兼具經(jīng)濟(jì)型和廣譜型的抗菌劑，近年來被作為促生長(zhǎng)劑[11]、免疫興奮劑[12]、抗菌藥物[13]、抗病毒藥物[14]、抗真菌藥物[15]、抗應(yīng)激藥物[16]廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。中藥抑菌常見的機(jī)制為中藥有效成分通過與細(xì)菌細(xì)胞膜、細(xì)胞壁、酶等結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或者酶變性，以多靶點(diǎn)的方式抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)或殺死病原菌[17]。本研究發(fā)現(xiàn)在單藥的抑菌圈分析中，五味子同時(shí)對(duì)3株供試菌株的抑菌效果最明顯。類似的研究也表明，五味子是一種潛在廣譜抗菌藥，對(duì)多種病原菌如多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)、河流弧菌(Vibriofluvialis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)等具有較好的抑菌效果[18-21]。

進(jìn)一步分析丁香、羅漢果、山茱萸、五味子和黃連等藥物對(duì)3種病原菌的MIC和MBC表明，山茱萸對(duì)3種病原菌的MIC和MBC值最低。山茱萸抑菌效果可能與其含有多種次生代謝物如馬錢苷、單寧(鞣酸)等酚類物質(zhì)以及酒石酸、蘋果酸和沒食子酸等有機(jī)酸有關(guān)[22]。有研究表明，酚類物質(zhì)可通過破壞膜完整性和膜蛋白、影響DNA和RNA的合成、破壞線粒體功能等多種模式發(fā)揮抗菌活性[23,24]。鞣酸等有機(jī)酸可與細(xì)菌鞭毛、菌體表面酶類等結(jié)合，影響病菌的運(yùn)動(dòng)能力或使水解酶等失活，導(dǎo)致病原菌因細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和代謝停滯而死亡[25]。Payne等[26]發(fā)現(xiàn)單寧可通過抑制細(xì)菌葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性，從而抑制細(xì)菌生物膜的形成。雖然，本研究的結(jié)果表明12種中藥提取物大部分都能抑制或殺滅供試菌株的生長(zhǎng)，但同一菌株對(duì)不同的中藥也表現(xiàn)出不同的敏感性。這可能與不同致病菌對(duì)不同中藥所含有效抗菌成分的敏感度不同有關(guān)，因此在實(shí)際使用中應(yīng)根據(jù)病原菌的種類選擇合適的藥物。

中藥復(fù)方由多種藥物組成，合理的單味藥配伍組成復(fù)方可協(xié)同增效，抑菌效果比單味中藥更佳[27]。同時(shí)，不同藥物的配伍組方也有助于降低藥物劑量的使用，降低毒性和細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)[28,29]。多種中藥配伍使用產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)可能與多種中藥有效化學(xué)成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同抑菌有關(guān)[30]。Pei等[31]的研究指出丁香油酚/香芹酚的協(xié)同作用可能與香芹酚瓦解桿菌外膜，使丁香油酚更容易進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合有關(guān)。Zhou等[32]的研究表明百里香酚可增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，從而使肉桂醛更容易進(jìn)入細(xì)胞。中藥配伍產(chǎn)生拮抗減效可能與針對(duì)相關(guān)病原菌的有效成分在配伍組合中因相互結(jié)合、吸附等物理作用而降低有效成分的濃度，或者發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而失去原有的抗菌活性等因素有關(guān)。本研究中結(jié)果表明，不同中藥聯(lián)合使用對(duì)不同致病菌的抑制效果存在差異。其中，10種組合對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌效果均表現(xiàn)為顯著協(xié)同或協(xié)同作用，對(duì)溶藻弧菌的抑菌效果均表現(xiàn)為協(xié)同作用，對(duì)副溶血弧菌的抑菌效果則是無關(guān)甚至拮抗。這可能與副溶血弧菌對(duì)藥物敏感性的機(jī)制與嗜水氣單胞菌和溶藻弧菌存在顯著差異相關(guān)。因此，本研究中12種中藥及其組方對(duì)3種病原菌的有效抑菌成分以及抑菌機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。