倪康達(dá)，劉慶華，侯 鑫，張凱軍，陳海紅，王 軍，王成輝

(1.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心/ 上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2.上海福歲樂生物科技有限公司，上海 200433)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)俗稱河蟹，是我國重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)生物。近年來，我國河蟹養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，全國28個(gè)省市區(qū)養(yǎng)殖，2019年全國成蟹產(chǎn)量達(dá)77.9萬噸[1]，已成為特種水產(chǎn)品中最具競爭力的產(chǎn)業(yè)之一。由于中華絨螯蟹具有較長時(shí)間的離水存活能力，鮮活個(gè)體可達(dá)全國各地甚至海外銷售，消費(fèi)區(qū)域和版圖不斷擴(kuò)大。特別是近年來隨著互聯(lián)網(wǎng)和電商經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，越來越多的中華絨螯蟹產(chǎn)品銷售從線下轉(zhuǎn)移到線上[2-3]，這就要求貯運(yùn)期間既要保持河蟹鮮活，又要節(jié)約成本。但中華絨螯蟹在貯運(yùn)過程中的活力與營養(yǎng)價(jià)值會發(fā)生怎樣的變化，如何確定最佳的貯運(yùn)時(shí)間尚缺乏研究。

近年來，水產(chǎn)品在貯運(yùn)流通過程中的品質(zhì)變化已引起術(shù)界的廣泛關(guān)注[4-6]。貯運(yùn)環(huán)節(jié)是中華絨螯蟹供應(yīng)鏈中極為重要的一環(huán)，但當(dāng)前主要對其貯藏過程中的品質(zhì)變化作了較多研究。劉小莉等[7]研究發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹蟹肉經(jīng)凍藏后，生物胺含量明顯降低。朱勤等[8]的研究表明，更低的凍結(jié)溫度能有效減緩中華絨螯蟹蟹肉蛋白質(zhì)變性和脂肪酸氧化。邵俊杰等[9]研究發(fā)現(xiàn)，低溫凍結(jié)中的液氮速凍法可以最大限度保持蟹肉的品質(zhì)。陳舜勝等[10]發(fā)現(xiàn)蟹肉凍藏超過2周后會導(dǎo)致品質(zhì)下降，建議中華絨螯蟹的凍結(jié)時(shí)間不宜太久。然而，作為電商貯運(yùn)高度發(fā)達(dá)的中華絨螯蟹，其在活體物流貯運(yùn)過程中的品質(zhì)變化尚未見報(bào)道。

本研究模擬當(dāng)前中華絨螯蟹電商貯運(yùn)過程中的基本條件，分析了分別貯運(yùn)24、48和72 h后中華絨螯蟹商品蟹的活力情況；同時(shí)，重點(diǎn)比較了不同貯運(yùn)時(shí)間下肝胰腺(蟹黃)的營養(yǎng)品質(zhì)變化，以便為其產(chǎn)業(yè)供應(yīng)鏈中的商品蟹合理貯運(yùn)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與貯運(yùn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)蟹來源于上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動物種質(zhì)試驗(yàn)站的中華絨螯蟹“江海21”二齡成蟹。隨機(jī)挑選體重120～150 g的雌蟹45只，150～200 g的雄蟹45只，共90只。選用上海福歲樂生物科技有限公司商品蟹泡沫包裝盒9個(gè)，規(guī)格為27 cm×13 cm×18 cm，同時(shí)在每個(gè)泡沫箱底部放置單重250 g的冰袋2個(gè)。先對每只實(shí)驗(yàn)蟹進(jìn)行背甲的個(gè)體編號，干露空氣10 min后，電子天平稱量其體質(zhì)量(精確度至0.01 g)，游標(biāo)卡尺測量其殼長(精確至0.01 mm)。然后用同等規(guī)格繩索捆扎河蟹，每個(gè)泡沫箱放置雌、雄各5只蟹(共10只蟹)，正常姿態(tài)放置(即背上腹下，雄下雌上)。同時(shí)在每個(gè)泡沫箱上層蟹背處放置一個(gè)溫度記錄儀(購自江蘇精創(chuàng)電氣股份有限公司，型號RC-4)，設(shè)置每3 min自動記錄一次箱內(nèi)溫度。最后用膠帶紙密封泡沫箱，參照快遞物流中運(yùn)輸非冷鏈運(yùn)輸環(huán)境，轉(zhuǎn)存室內(nèi)陰涼干燥處保存，周邊放置溫度記錄儀3個(gè)，記錄室溫。

本試驗(yàn)設(shè)置24、48和72 h共三個(gè)保貯時(shí)間梯度，每個(gè)時(shí)間梯度3個(gè)重復(fù)。當(dāng)各貯運(yùn)時(shí)間結(jié)束時(shí)，觀察并統(tǒng)計(jì)河蟹死亡率和活力大小然后稱重，活體解剖前在冰上進(jìn)行麻醉，沿蟹殼側(cè)面將蟹殼與軀體分離，取出全部肌肉和肝胰腺并準(zhǔn)確稱量。為保證后續(xù)分析所需的足夠樣本量，本實(shí)驗(yàn)將雌、雄蟹各2只(共4只)的肝胰腺組織混合成一個(gè)分析樣本，肝胰腺樣品利用真空冷凍干燥機(jī)(購自上海力辰邦西儀器科技有限公司，型號LC-10N-50A)進(jìn)行冷凍干燥，最后將樣品研磨至粉末，干燥密封低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

通過如下公式計(jì)算保貯河蟹的肝胰腺指數(shù)(HIS)、出肉率(MY)和肥滿度(CF):

HIS=(HW/BW1)×100%

MY=(BW2/BW1)×100%

CF=BW1/L×100%

式中：HW為肝胰腺質(zhì)量，g；BW1為河蟹體質(zhì)量，g；BW2為河蟹肌肉質(zhì)量，g；L為河蟹殼長，cm。

1.2 不同貯運(yùn)時(shí)間的中華絨螯蟹死亡率與活力評價(jià)

各試驗(yàn)時(shí)間段結(jié)束后，首先利用感官評價(jià)法，判斷中華絨螯蟹是否死亡，統(tǒng)計(jì)死亡率。然后根據(jù)翻身所需時(shí)間、觸碰眼柄的回彈速度以及爬行情況等對每只中華絨螯蟹的活力進(jìn)行評價(jià)[11]，具體方法如表1所示。最后，統(tǒng)計(jì)比較不同貯運(yùn)時(shí)間中華絨螯蟹各活力等級的百分率。

1.3 不同貯運(yùn)時(shí)間的肝胰腺基本營養(yǎng)指標(biāo)測定

肝胰腺的水分含量采用冷凍干燥法進(jìn)行測定；粗蛋白含量測定參考凱氏定氮法(GB/T5009.5-2016)；粗脂肪含量測定參考索氏提取法(GB/T14772-2016)；灰分含量測定參考高溫灰化法(GB5009.4-2016)。

表1 本研究中的中華絨螯蟹活力評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 The standard of vigor state evaluation in the studied E.sinensis

1.4 不同貯運(yùn)時(shí)間的肝胰腺氨基酸與脂肪酸組成測定

準(zhǔn)確稱取經(jīng)冷凍干燥后的樣品0.10 g，移至15 mL水解管中，加入5 mL 6 mol/L鹽酸溶液，用氮?dú)獬錆M水解管，在酒精噴燈下快速密封，將水解管放在(110±1) ℃的電熱鼓風(fēng)恒溫箱中水解22 h后，取出冷卻至室溫。之后移至容量瓶，用蒸餾水定容至50 mL，期間用蒸餾水反復(fù)洗滌水解管三次，然后準(zhǔn)確吸取1 mL濾液進(jìn)行冷凍干燥，滴入1.0 mL 0.02 mol/L HCl將樣品溶解，使用孔徑為22 μm的水相微孔濾膜過濾該溶液。最后應(yīng)用氨基酸自動分析儀(日本株式會社日立高新技術(shù)科學(xué)，型號LA8080)測定氨基酸的組成。

準(zhǔn)確稱取經(jīng)冷凍干燥后的樣品0.50 g，移至100 mL燒杯中，加入10 mL氯仿-甲醇溶液浸泡30 min，用濾紙過濾至250 mL的蒸餾瓶中，重復(fù)上述步驟三次。將濾液蒸干得到粗脂肪后，繼續(xù)加入2 mL 2%氫氧化鈉甲醇溶液，85 ℃水浴鍋中皂化30 min，冷卻至室溫后，加入3 mL 14%三氟化硼甲醇溶液進(jìn)行甲脂化處理。然后在離心管中加入正己烷1 mL，震蕩萃取2 min，靜置等待分層，取上層清液100 μL，用正己烷定容到1 mL。最后用0.45 μm濾膜過膜后，使用氣相色譜儀(Agilent，型號7890A)測定脂肪酸的組成。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)的形式表示，方差齊性用Levene檢驗(yàn)，顯著性差異使用單因素方差分析(ANOVA)和多重比較(LSD)，設(shè)置P<0.05為差異顯著性，相關(guān)作圖應(yīng)用Origin8.0pro軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯運(yùn)時(shí)間的貯運(yùn)箱內(nèi)溫度變化

通過對貯存箱內(nèi)溫度的連續(xù)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)在12 h內(nèi)，箱內(nèi)溫度維持在(10.7±1.2) ℃。12 h后箱內(nèi)溫度開始高攀式增長，至30 h左右時(shí)，達(dá)到箱外溫度水平，接著繼續(xù)升高并超過箱外溫度，直到試驗(yàn)結(jié)束，箱內(nèi)溫度始終高于箱外溫度(圖1)。綜上可得，當(dāng)前貯運(yùn)河蟹所用冰袋只能維持12 h左右的低溫狀態(tài)。

圖1 不同貯運(yùn)時(shí)間的箱內(nèi)外溫度變化Fig.1 The changes of inbox and outbox temperature at different storage and transportation times

2.2 不同貯運(yùn)時(shí)間的中華絨螯蟹死亡率與活力變化

在本試驗(yàn)中，貯運(yùn)24 h的中華絨螯蟹未見死亡，貯運(yùn)48 h后死亡3只，死亡率為10.0%；貯運(yùn)72 h后死亡12只，死亡率達(dá)40.0%，表明隨著貯運(yùn)時(shí)間的延長，河蟹的死亡率會急劇上升。

活力評價(jià)發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹經(jīng)過24 h貯運(yùn)后，活力達(dá)4級的有28只，占93.33%，其余2只的活力均達(dá)3級。經(jīng)48 h后，活力達(dá)4級的有18只，占60.00%，3級的有5只，占16.67%，2級的有4只，占13.33%。但經(jīng)過72 h后，活力達(dá)4級的僅有1只，只占3.33%，3級的有3只，占10.00%，2級和1級的總數(shù)達(dá)14只，占46.67%，活力低迷。具體如表2所示。

2.3 中華絨螯蟹體質(zhì)量、可食組織指數(shù)、肥滿度和肝胰腺基本營養(yǎng)成分變化

河蟹經(jīng)過不同時(shí)間貯運(yùn)后，均存在體重下降現(xiàn)象(即失重率)，貯運(yùn)時(shí)間越長，失重率越高(表3)。同樣，水分和灰分也相應(yīng)下降，特別是貯運(yùn)72 h后的灰分下降顯著。其它營養(yǎng)指標(biāo)，如肥滿度、肝胰腺指數(shù)、出肉率、粗脂肪，沒有隨著貯運(yùn)時(shí)間的延長而發(fā)生顯著變化。

表2 不同貯運(yùn)時(shí)間中華絨螯蟹的活力分布Tab.2 The distribution of vigor state of E.sinensis at different storage and transportation times

2.4 不同貯運(yùn)時(shí)間的肝胰腺氨基酸組成變化

本試驗(yàn)共檢測出肝胰腺中的17種氨基酸(表4)，其中7種為必需氨基酸(EAA)，10種為非必需氨基酸(NEAA)。除蘇氨酸(Thr)、蛋氨酸(Met)和丙氨酸(Ala)外，其余14種氨基酸的含量均表現(xiàn)為貯運(yùn)48 h和72 h后顯著低于24 h，但48 h和72 h間不存在顯著差異，這與表2中粗蛋白含量下降規(guī)律一致。因而，包括EAA、NEAA和總氨基酸量(TAA)，也表現(xiàn)為貯運(yùn)48 h和72 h均顯著低于24 h，而貯運(yùn)48 h和72 h間沒有顯著性差異。

2.5 肝胰腺脂肪酸組成變化

本試驗(yàn)共檢測到肝胰腺中的24種脂肪酸(表5)，包括10種飽和脂肪酸(SFA)、6種單不飽和脂肪酸(MUFA)和8種多不飽和脂肪酸(PUFA)，其中MUFA含量最高，約占SFA總量的44%。除了二十二碳酸(C22:0)含量在72 h顯著低于24 h外，其余23種脂肪酸含量在三個(gè)貯運(yùn)時(shí)間均無顯著性差異，這與表2中粗脂肪含量無明顯變化規(guī)律一致。因而，包括ΣSFA、ΣMUFA、ΣPUFA、ΣFA、Σn-3PUFA、Σn-6PUFA和Σn-3/Σn-6，也表現(xiàn)為不同貯運(yùn)時(shí)間均無顯著性差異。

3 討論

3.1 不同貯運(yùn)時(shí)間對中華絨螯蟹成活率和活力的影響

冰藏是將水產(chǎn)品包埋于冰塊中進(jìn)行貯藏[12]，也是河蟹最常用的貯運(yùn)保鮮方法。但隨著貯運(yùn)時(shí)間延長，冰塊逐漸融化，環(huán)境溫度也隨著升高，無法長期維持低溫狀態(tài)。當(dāng)前的河蟹貯運(yùn)均是利用泡沫箱為貯運(yùn)容器，冰袋或冰瓶作為降溫介質(zhì)，一旦冰塊全部融化，箱內(nèi)溫度升高，就會對河蟹生存造成嚴(yán)重威脅。有研究發(fā)現(xiàn)河蟹死亡10 h后腐敗氣味發(fā)生，體內(nèi)有毒物質(zhì)開始累積，品質(zhì)敗壞，失去食用價(jià)值[13]，故貯運(yùn)時(shí)間對河蟹成活率和營養(yǎng)品質(zhì)具有重要影響。本試驗(yàn)比較了不同貯運(yùn)時(shí)間內(nèi)中華絨螯蟹的死亡率和活力，結(jié)果顯示：隨著貯運(yùn)時(shí)間延長，河蟹死亡率急劇上升，活力也隨之降低，特別是超過48 h后，河蟹死亡率從10%升至40%，活力大幅度減弱。這是因?yàn)楹有纷陨泶x旺盛，呼吸作用消耗氧氣，冰塊融化無法繼續(xù)維持低溫環(huán)境，導(dǎo)致貯運(yùn)箱內(nèi)溫度增高，氧氣漸漸耗盡，河蟹受到低氧脅迫和高溫威脅。相關(guān)研究表明，低氧脅迫會影響水生動物的生長和生理機(jī)能，導(dǎo)致抗逆能力下降甚至死亡[14-15]，高溫會使甲殼動物代謝紊亂，機(jī)體免疫力下降[16-17]。故貯運(yùn)時(shí)間越長，越不利河蟹生存，這與謝雅雯[18]的研究結(jié)果相似。由此可知，若想提高河蟹貯運(yùn)存活率或延長理想貯運(yùn)時(shí)間，需尋找比冰袋更好的降溫介質(zhì)或更好的保溫措施，使得箱內(nèi)溫度盡可能長時(shí)間維持在低溫狀態(tài)，并確保箱內(nèi)含氧量充裕。綜上，本試驗(yàn)認(rèn)為河蟹理想的貯運(yùn)時(shí)間為48 h以內(nèi)，期間河蟹成活率和活力都較強(qiáng)。

表3 不同貯運(yùn)時(shí)間中華絨螯蟹的體質(zhì)量、可食組織指數(shù)、肥滿度和肝胰腺營養(yǎng)成分變化Tab.3 The changes of body weight,edible tissue indices,condition factor and hepatopancreas nutrients of E.sinensis at different storage and transportation times

表4 不同貯運(yùn)時(shí)間中華絨螯蟹肝胰腺氨基酸的組成(mg/g 干重,n=6混樣)Tab.4 Amino acid composition in the hepatopancreas of E.sinensis in different storage and transportation times (mg/g dry weight,n=6)

表5 不同貯運(yùn)時(shí)間中華絨螯蟹肝胰腺脂肪酸的組成(mg/g干重,n=6混樣)Tab.5 Fatty acid composition in the hepatopancreas of E.sinensis in different storage and transportation times (mg/g dry weight,n=6)

3.2 不同貯運(yùn)時(shí)間中華絨螯蟹體質(zhì)量、出肉率和肝胰腺基本營養(yǎng)成分比較

在本試驗(yàn)中，河蟹經(jīng)過不同時(shí)間貯運(yùn)后，體質(zhì)量和肝胰腺水分含量均存在下降現(xiàn)象，但均無顯著差異，說明隨著貯運(yùn)時(shí)間延長，河蟹機(jī)體的水分正不斷流失。另外，貯運(yùn)期間河蟹肝胰腺指數(shù)和出肉率無明顯變化，這一方面表明貯運(yùn)期間河蟹體質(zhì)量減少主要是因?yàn)闄C(jī)體水分參與呼吸作用而水分含量下降，另一方面也表明河蟹在貯運(yùn)過程能量消耗低，代謝較慢，抗饑餓能力較強(qiáng)。肝胰腺是蟹類營養(yǎng)物質(zhì)(尤其是脂質(zhì))儲備的主要組織，為機(jī)體能量代謝和卵巢發(fā)育提供能量來源。本試驗(yàn)中河蟹肝胰腺的粗蛋白質(zhì)含量很少，而粗脂肪含量卻很高，這是因?yàn)楹有犯我认俑缓罅恐|(zhì)，而絕大部分蛋白質(zhì)存在于蟹肉，這與Wu等[19]的研究結(jié)果相似。

3.3 不同貯運(yùn)時(shí)間中華絨螯蟹肝胰腺氨基酸、脂肪酸組成比較

蟹類可食組織中的氨基酸、脂肪酸組成和含量是評價(jià)其營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)[20]。本試驗(yàn)共檢測出17種氨基酸，其中14種在貯運(yùn)48 h和72 h后顯著低于24 h，由于氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，因此粗蛋白質(zhì)和總氨基酸含量變化也符合上述規(guī)律，推測可能由于內(nèi)源酶和外源微生物的共同作用[21]，導(dǎo)致氨基酸分解，肝胰腺品質(zhì)在貯運(yùn)24 h后迅速下降；也有可能是在貯運(yùn)時(shí)間內(nèi)，河蟹優(yōu)先利用蛋白質(zhì)或氨基酸作為主要消耗源來應(yīng)對饑餓，這與斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)應(yīng)對饑餓的方式相似[22]。故本試驗(yàn)認(rèn)為肝胰腺氨基酸營養(yǎng)價(jià)值在貯運(yùn)0～24 h內(nèi)最佳，超過24 h后下降明顯。脂肪酸是人體主要能源來源之一[23]，本研究中，河蟹肝胰腺中MUFA總含量最多，約占脂肪酸總量的44%，這與孫遠(yuǎn)明[24]的研究相似，平衡充裕的MUFA對人體營養(yǎng)健康十分重要[25-26]。另外，河蟹肝胰腺中23種脂肪酸的含量表現(xiàn)為在不同貯運(yùn)時(shí)間均無顯著性差異，由于脂肪酸是構(gòu)成脂肪的主要成分，因此粗脂肪和總脂肪酸含量變化也符合上述規(guī)律，推測是河蟹在貯運(yùn)期間代謝緩慢，肝胰腺中的脂類物質(zhì)只有微量或沒有被機(jī)體代謝使用，或是其他組織中的脂肪酸優(yōu)先消耗，使得肝胰腺中各脂肪酸含量在貯運(yùn)時(shí)間0～72 h內(nèi)沒有出現(xiàn)明顯變動，也表明了貯運(yùn)期間0～72 h肝胰腺的脂肪酸營養(yǎng)價(jià)值變化不大，具體原因則需進(jìn)一步的探究。

綜上，貯運(yùn)時(shí)間0～48 h內(nèi)，河蟹成活率高，活力強(qiáng)勁。超過48 h后，河蟹的成活率和活力將明顯下降，嚴(yán)重影響河蟹的食用價(jià)值；超過24 h后，河蟹肝胰腺的氨基酸含量下降明顯，而脂肪酸含量在0～72 h均無明顯變化。故綜合成活率、活力和肝胰腺營養(yǎng)品質(zhì)，認(rèn)為當(dāng)前流通環(huán)境下，河蟹的最佳貯運(yùn)時(shí)間為0～24 h。