魏域玲，溫 彬，高建忠，陳再忠

(1.上海海洋大學國家水產(chǎn)科學實驗教育示范中心，上海 201306； 2.上海海洋大學農(nóng)業(yè)與農(nóng)村部淡水水生遺傳資源重點實驗室，上海 201306； 3.上海水生動物遺傳育種協(xié)同創(chuàng)新，上海海洋大學，上海 201306； 4.上海海洋大學上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程研究中心，上海 201306)

七彩神仙魚(Symphysodonharaldi)[1]隸屬于鱸形目(Perciformes)慈鯛科(Cichlidae)，原產(chǎn)于亞馬遜河流域，經(jīng)人工馴養(yǎng)和繁殖成為最具觀賞價值的熱帶觀賞魚之一[2]。七彩神仙魚幼魚會啄食親魚體表的粘液[3，4]，這種特殊的行為與哺乳動物的哺育行為非常相似。

同源異形框基因2(orthodenticle homeobox 2，otx2)[5,6]屬otx家族[7]，其編碼的蛋白質(zhì)作為轉(zhuǎn)錄因子，在腦[8]、顱面和感覺器官發(fā)育中都發(fā)揮重要的作用[7，9-10]。同時，otx2還是影響多巴胺神經(jīng)元產(chǎn)生的一個關(guān)鍵基因[8]，能夠調(diào)節(jié)中腦基底盤的神經(jīng)元產(chǎn)生的活性和多巴胺前體細胞的增殖及分化[11]。而多巴胺在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有著極其重要的生理功能，包括運動的整合、認知、情感、獎賞、意識和記憶[11，12]。

本研究對七彩神仙魚otx2基因全長進行克隆，驗證并分析了該基因在不同組織中的表達，并在七彩神仙魚腦組織中對該基因進行定位，旨在預測otx2基因在七彩神仙魚親代撫育過程中可能起到的作用，為了解七彩神仙魚親代撫育提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用魚取自上海海洋大學濱?；?，選取六尾雌性七彩神仙魚親魚，分別取腦、肌肉、性腺、皮膚、肝臟、心臟、腸道和腎臟組織，迅速置于液氮，-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA的合成

采用Trizol(Invitrogen 公司)試劑盒，根據(jù)試劑盒說明提取七彩神仙魚各組織RNA，其質(zhì)量檢測方法參照實驗室已有技術(shù)[2]。以提取的RNA為模板，按照PrimeScriptTMRT kit試劑盒(TaKaRa，上海生工生物公司)說明書合成cDNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物合成

從本實驗室測定腦組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中選取otx2片段設(shè)計引物Otx2-F-Primer和Otx2-R-Primer(表1)，用于七彩神仙魚otx2基因擴增。根據(jù)克隆驗證得到的otx2基因序列設(shè)計熒光定量 PCR 特異性引物Otx2-qPCR-F 和Otx2-qPCR-R；采用本實驗室之前所用的七彩神仙魚內(nèi)參基因β-actin 設(shè)計基因引物β-actin-qPCR-F和β-actin-qPCR-R，上述引物均采用 Primer 5.0 設(shè)計，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

表1 七彩神仙魚otx2基因克隆及熒光定量PCR引物Tab.1 Cloning and fluorescence quantitative primers of otx2 gene in S.haraldi

1.2.3Otx2基因的克隆

以七彩神仙魚腦組織的cDNA為起始模板，加入2.5 mmol/L dNTP Mixture，4 μL；10×PCR buffer，5 μL；Otx2-F-Primer和Otx2-R-Primer各2 μL；TaKaRa Taq TM(5 U/μL)，0.5 μL；cDNA，3 μL；ddH2O補齊至 50 μL。反應程序為 94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延申1 min，循環(huán)35次，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃終止程序。PCR 反應結(jié)束后，在1%的瓊脂糖凝膠電泳中以D2000 DNA Marker作為分子質(zhì)量標準進行檢測,并置于紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果，產(chǎn)物回收送上海生工測序。

1.2.4Otx2基因的生物信息學分析

采用 DNAMAN 軟件將測序所得cDNA序列進行拼接，運用BLAST查詢該物種在數(shù)據(jù)庫中同其他物種的otx2基因序列同源性相似程度；使用生物信息學網(wǎng)絡(luò)平臺NCBI上的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)工具分析七彩神仙魚otx2基因序列的開放閱讀框，進一步推導出該基因的氨基酸序列；使用NCBI的CD Search程序搜索該基因的蛋白功能結(jié)構(gòu)域；采用SMART 分析蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域；運用Phyre2預測otx2蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)；采用DNAMAN軟件進行氨基酸序列多重對比；最后使用Clustal X和MEGA 7軟件基于Neighbor Joining鄰接法對其構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 七彩神仙魚otx2基因的表達分析

采用相對定量的方法對七彩神仙魚otx2基因在不同組織的表達量進行測定。以各個組織的總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為起始模板，選擇內(nèi)參β-actin 基因，目標基因otx2，分別對所選不同組織進行實時熒光定量 PCR 反應，每個樣品重復測定 3 次。實驗室采用BIO-RAD CFX 96定量PCR儀，SYBR Green I熒光染料。以 20 μL為反應體系，其中2×SuperReal PreMix Plus(TianGen)10 μL，正反向引物各 0.6 μL，cDNA 模板為 1 μL，最后補齊RNase Free dH2O 7.8 μL。反應程序：95 ℃ 5 min，1個循環(huán)；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，39個循環(huán)；95 ℃ 30 s，1個循環(huán)。根據(jù)otx2基因和 β-actin 基因在各組織中擴增得到的Ct值，通過 2-ΔCt法計算七彩神仙魚各組織中otx2基因的相對表達量。采用Graphpad 7.0 進行組織表達譜分析。

1.2.6 石蠟切片的制作和原位雜交實驗

腦組織取出洗凈后立即放入4%多聚甲醛固定液(DEPC水配制)中固定2～12 h。之后經(jīng)梯度酒精脫水后浸蠟、包埋和切片。再根據(jù)腦組織固定時間長短，切片在修復液中煮沸10～15 min，自然冷卻。后用基因筆畫圈，滴加蛋白酶K(20 μg/mL)37 ℃消化30 min，用純水沖洗后PBS洗3次×5 min。然后滴加預雜交液，37 ℃孵育1 h。之后傾去預雜交液，滴加含探針雜交液(探針合成序列為：5-CY3-AGUAGUCCUUUCUCGCCUCUGCUUCCGUG 3,由上海生工生物工程股份有限公司合成探針雜交液)，濃度5 ng/μL，恒溫箱37 ℃雜交12 h，洗去雜交液(2X SSC，37 ℃ 洗10 min，1X SSC，37 ℃洗2×5 min，0.5X SSC室溫洗10 min)。之后用DAPI復染核[切片滴加DAPI染液(2 μg/mL)避光孵育8 min]，沖洗后滴加抗熒光淬滅封片劑封片。最后鏡檢拍照(切片正置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像)。

2 結(jié)果與分析

2.1 七彩神仙魚otx2基因克隆和序列分析

結(jié)果顯示otx2基因的cDNA序列CDS區(qū)序列長度為873 bp(圖1),包括290個氨基酸序列編碼的873 bp完整的開放閱讀框(圖2)。對開放閱讀框進行生物信息學分析，得到otx2基因的蛋白分子質(zhì)量為31 771.55 Da，理論等電點為 9.40。用Phyre2預測了七彩神仙魚otx2基因蛋白三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)了otx2基因的結(jié)構(gòu)域空間位置在第42～94個氨基酸之間，另一個是在第154～235個氨基酸之間(圖3)。

2.2 Otx2基因的同源比較和進化分析

圖1 七彩神仙魚otx2基因 PCR 擴增結(jié)果Fig.1 The PCR amplification results of otx2 gene of S.haraldi 1:七彩神仙魚擴增結(jié)果；marker：DNA marker

圖2 七彩神仙魚otx2基因的cDNA序列和推測的氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence and the predicted amino acid sequence of otx2 gene in S.haraldi ATG為翻譯起始子，*為翻譯結(jié)束終止子，紅線標記為氨基酸的結(jié)構(gòu)域

圖3 Phyre2軟件預測七彩神仙魚蛋白結(jié)構(gòu)Fig.3 Phyre2 software predicts the protein structure of S.haraldi NT:氨基端；CT：c端 ；紅色:α螺旋

圖4 七彩神仙魚與其他物種otx2基因的氨基酸序列比對分析Fig.4 Multiple sequence alignment analysis of amino acid sequences of otx2 gene in S.haraldi

2.3 不同組織中otx2基因的表達分析

通過q-PCR方法檢測七彩神仙魚otx2基因在不同組織中的表達水平，otx2基因在腦組織中表達量較高，其它組織中的表達量較少，其中在心臟組織中表達量高于性腺、腸道、腎臟、肝臟、肌肉和皮膚組織(圖6)。因此otx2基因在七彩神仙魚不同組織中的表達水平情況存在差異性。

2.4 Otx2基因的原位雜交結(jié)果

七彩神仙魚成熟雌性腦組織橫切面的原位雜交結(jié)果顯示otx2探針在七彩神仙魚中腦的小球周灰質(zhì)帶、縱枕、頂蓋室等區(qū)域均有表達(圖7)。

圖5 基于不同物種的otx2氨基酸序列構(gòu)建的鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic trees of different species on amino acid sequence of otx2 using neighbor joining method

圖6 七彩神仙魚不同組織otx2基因熒光定量分析Fig.6 Fluorescence quantitative analysis of otx2 gene of S.haraldi in different tissues

圖7 otx2在七彩神仙魚腦組織熒光原位雜交Fig.7 Fluorescence in Situ hybridization of otx2 in the brain of S.haraldi TI:縱枕；PGZ:小球周灰質(zhì)帶；TeV:頂蓋室

3 討論

本研究從七彩神仙魚腦組織中克隆了otx2基因，蛋白分析軟件Phyre2構(gòu)建了七彩神仙魚的蛋白結(jié)構(gòu)預測圖及其結(jié)構(gòu)域。同時，氨基酸同源性分析結(jié)果表明七彩神仙魚與大多數(shù)魚類的otx2類似具有較高的保守性。另外，七彩神仙魚與尼羅羅非魚的otx2氨基酸序列具有較高的相似性，而七彩神仙魚和尼羅羅非魚又均屬于慈鯛科[13]，因此這一結(jié)果驗證了克隆得到的otx2基因序列的可靠性，對于該基因在調(diào)節(jié)七彩神仙魚特殊的行為的基因功能預測中起到促進作用。

熒光定量PCR結(jié)果顯示，otx2基因在七彩神仙魚各組織中的表達量存在差異。otx2基因在七彩神仙魚大腦組織中的表達量與其他組織的表達量相比較是最高，這與牙鲆(Paralichthysolivaceus)[5]、斑馬魚(Brachydaniorerio)[14]、人類(homosapiens)[15]中的實驗結(jié)果相似。在大腦、顱面和感覺器官發(fā)育中都發(fā)揮著非常重要的作用[7，9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)otx2基因在神經(jīng)系統(tǒng)模式形成、細胞命運規(guī)范和分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。

通過原位雜交，我們在七彩神仙魚中腦的小球周灰質(zhì)帶、縱枕、頂蓋室發(fā)現(xiàn)otx2基因。眾所周知中腦與情緒活動有關(guān)[16]，中腦頂蓋接受多方面的神經(jīng)纖維[17]，它不僅是視、聽反射的中樞，還可能是觸覺、溫度覺、痛覺的整合中樞[17,18]。由此可以推測七彩神仙魚被幼魚啄食時可能會發(fā)生觸覺、痛覺等。不僅如此，多巴胺還與牛奶的分泌有關(guān)[19]。七彩神仙魚這種用粘液喂食幼魚的行為可能與哺乳動物的哺育行為相似，它皮膚表皮分泌的粘液可能與哺乳動物分泌的牛奶[20]類似。因此otx2基因在七彩神仙魚親代撫育時在中腦中發(fā)揮的作用更加值得我們?nèi)ヌ骄俊?/p>

4 結(jié)論

本試驗通過克隆得到七彩神仙魚雌性otx2基因，并對該基因進行生物信息學分析，該基因具有典型的otx保守結(jié)構(gòu)域。運用實時熒光定量 PCR 對otx2基因在雌性七彩神仙魚各組織中的表達差異進行了分析，得到otx2基因在中腦中高表達，并且在其他組織中也有表達。同時通過原位雜交技術(shù)得到otx2基因在雌性七彩神仙魚中腦的小球周灰質(zhì)帶、縱枕、頂蓋室均有表達。本研究為探討otx2基因在雌性七彩神仙魚親代撫育調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。