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        磷化氫生物凈化體系及抑制作用機理

        2021-05-28 15:58:44劉樹根
        中國環(huán)境科學 2021年5期
        關鍵詞:魚藤酮混合液活性氧

        余 碩,劉樹根,李 婷

        磷化氫生物凈化體系及抑制作用機理

        余 碩,劉樹根*,李 婷

        (昆明理工大學環(huán)境科學與工程學院,云南 昆明 650500)

        在PH3生物凈化體系中添加呼吸鏈電子傳遞抑制劑,對比分析微生物生長代謝、磷的遷移轉化、活性氧(ROS)產生及氧化酶活性等變化規(guī)律.當魚藤酮或抗霉素A分別添加至R1、R2PH3生物反應器后,其微生物體O2-?含量在運行時間14~17d期間的平均值分別上升至0.68, 0.96mmol/g,明顯高于空白對照組R0反應器.除自由基O2-?外,另一類型的活性氧HO?也存在于PH3凈化系統(tǒng)中;受累積的活性氧影響,生物體內丙二醛(MDA)含量處于較高水平,PH3凈化效率通常不超過75%,添加抑制劑的R1與R2反應體系在15~17d期間PH3平均去除率分別下降至65.1%、59.5%. pH值、ROS含量以及氧化酶活性等因素均明顯影響PH3生物凈化效果,當Fe3+、Cu2+、Mg2+等金屬陽離子遷移轉運至微生物體內時,超氧化物歧化酶(SOD)與過氧化氫酶(CATase)活性得以不同程度的增強,可緩解活性物質O2-?或HO?導致的氧化脅迫作用,PH3凈化效能得以適度提升.

        PH3;生物轉化;抑制;活性氧

        PH3是自然界磷循環(huán)的重要物質形態(tài)和氣相載體,黃磷生產、電石制備、垃圾填埋、濕地沼澤等場所均可檢測到PH3存在[1-2].目前,工業(yè)生產過程高濃度PH3煙氣特征及凈化處理研究頗為深入,但污水處理廠、垃圾填埋場等處低濃度PH3的產生機制、尾氣凈化等問題并未得到充分關注.

        相比于催化轉化、化學吸收、碳基材料吸附等技術,低濃度PH3尾氣的生物處理具有運行成本較低、適應性強等優(yōu)點,具有良好的應用前景.鄧菁等[3]較早報道以PH3作為馴化氣體篩選功能微生物,并探究了金屬離子濃度、營養(yǎng)液等因素對菌種活性的影響.在穩(wěn)定運行的活性污泥處理體系中[4],碳源、pH值等工藝條件明顯影響PH3凈化效率.相比而言,采用生物滴濾系統(tǒng)[5-6]凈化PH3尾氣時,因復合填料能促進氣態(tài)PH3的吸附,凈化效果可達到80%;生物滴濾塔內具有較高的微生物種群多樣性,主要的細菌種屬有:鞘氨醇單胞菌()、嗜甲基菌()及伯克氏菌().

        已有研究同時表明,PH3對海洋微藻具有雙重作用:低濃度PH3誘導抗氧化酶活性的升高,對細胞增長具有一定的刺激作用;高濃度的PH3會損傷細胞膜系統(tǒng),對微藻的酶活性和基因表達等產生抑制作用[7]. PH3具有較強的生物毒性,它能抑制桔小實蠅、谷蠹、玉米象等體內的過氧化氫酶活性[8],并對該類昆蟲具有熏蒸殺滅效果;但水稻生長過程中,根際土壤中的堿性磷酸酶隨PH3濃度和暴露時間的增加而增加,反映了一定濃度的PH3對土壤磷表現(xiàn)出活化效應[9].

        采用生物技術凈化PH3尾氣時,系統(tǒng)的啟動與運行特征、微生物群落多樣性等已有研究報道[4-5],但PH3是否對生物凈化體系產生明顯抑制作用、如何緩解PH3生物毒性并提升生物凈化效果,這類深層次問題尚不明晰.本研究在PH3生物體系中添加特定的呼吸鏈電子傳遞抑制劑魚藤酮或抗霉素A以抑制電子傳遞過程的不同位點,對比分析PH3生物代謝過程中磷的遷移轉化過程、氧化酶活性以及活性氧變化規(guī)律,探究PH3生物凈化體系的抑制作用機理.研究成果為PH3生物轉化過程分析及效能提升提供參考.

        1 材料與方法

        1.1 微生物增殖培養(yǎng)

        從連續(xù)運行6個月的PH3生物凈化活性污泥體系[4]中選取微生物樣本,利用有效容積為6L的全自動發(fā)酵罐對微生物進行增殖培養(yǎng).培養(yǎng)過程中每隔24h從發(fā)酵罐內排出250mL混合液,同時加入等體積液體培養(yǎng)基.培養(yǎng)過程控制發(fā)酵罐內混合液pH值為7.0、溫度為25℃、溶解氧(DO)3.5mg/L、攪拌槳轉速120r/min.當混合培養(yǎng)液OD600值基本穩(wěn)定時,將其移入反應器中開展后續(xù)對比試驗.

        圖1 PH3生物凈化工藝流程

        1-PH3, 2-壓縮空氣, 3-N2, 4-質量流量計, 5-緩沖瓶, 6-水浴搖床, 7-吸收裝置, 8-多孔曝氣盤, 9-氣相色譜, 10-尾氣吸收裝置 11-出口尾氣

        液體培養(yǎng)基主要組分如下:C6H12O61.4g, (NH4)2SO40.165g,K2HPO4·3H2O 0.05g,MgSO40.10g, NaCl 0.15g,KCl 0.15g,FeCl30.015g,MnSO4·H2O 0.015g,CuSO4·5H2O 0.015g,CoCl2·6H2O 0.015g,配制成1L溶液,調節(jié)pH值至7.0,滅菌后備用.

        1.2 PH3生物凈化

        采用活性污泥體系對模擬的PH3混合氣進行凈化處理,工藝流程如圖1所示. 分別取2.0L增殖培養(yǎng)的微生物混合液至總容積3.0L的反應器R0、R1、R2中.生物凈化過程中,混合氣進氣流量為120mL/min,PH3濃度為5mg/m3;定期監(jiān)測吸收裝置進出口氣體中PH3濃度,計算其去除率.每24h從反應器內移出250mL混合液,及時加入等體積液體培養(yǎng)基,用0.5mol/L NaOH調節(jié)混合液pH值為7.0;隨后,R1與R2反應器中各自添加濃度為100μmol/L的抗霉素A與魚藤酮5mL,R0反應器中不添加外源抑制劑.

        收集生物凈化裝置定期排放的污泥混合液,測試pH值、OD600、酶活性等物化指標,并測定上清液中COD、可溶性總磷酸鹽(TP)與正磷酸鹽(Ortho-P)含量.

        1.3 分析測試方法

        采用氣相色譜儀(GC-9790plus,浙江福立儀器公司)檢測吸收裝置進出口氣相中PH3濃度.使用紫外可見分光光度計(HACH-DR600,美國哈希公司)于波長600nm處測試微生物增殖培養(yǎng)液以及凈化體系吸收混合液的吸光度,間接反應微生物的生長狀況.混合液pH值采用pH計(PHS-3C,上海雷磁儀電公司)測定.所有物化指標均進行3次平行測試.

        收集定期排出的活性污泥混合液,于12000條件下高速離心10min.所得上清液采用標準方法[10]測試其COD、TP等物化指標;采用電感耦合等離子體(PQ-9000,德國耶拿公司)測定金屬離子(Fe3+、Cu2+、Mn4+、Mg2+)濃度.所得底物添加磷酸鹽緩沖溶液并在冰浴條件下超聲破碎處理5min,之后用于酶活性指標測試,超氧化物歧化酶(SOD)活性根據(jù)黃嘌呤氧化酶--羥胺法測定,過氧化氫酶(CAT)活性根據(jù)標準GB/T 23195-2008[11]測定,氧負自由基(O2-?)采用改良羥胺氧化法分析[12],羥基自由基(HO?)利用電子順磁共振儀(EPR A300-6/1,德國布魯克公司)檢測[13],脂質過氧化物采用丙二醛(MDA)試劑盒(A003-1,南京建成生物公司)基于硫代巴比妥酸法進行測定[14].

        取部分活性污泥混合液進行超聲破碎(Scientz- 750F,寧波新芝生物科技公司)處理5min后,采用過硫酸鉀消解-鉬銻抗分光光度法測定其中的混合液總磷(STP)含量.

        2 結果與分析

        2.1 PH3去除效果

        按照對比試驗方案的設計,生物凈化裝置連續(xù)運行時,反應器內的污泥停留時間(SRT)為8d,取運行時間第7d后的測試結果比較分析. PH3去除率在運行前期波動較為明顯,運行時間達15d后,生物吸收體系的PH3凈化效果開始趨于穩(wěn)定(圖2);15~17d期間,R0、R1與R2三個生物反應器內的PH3平均去除率分別為71.4%、65.1%、59.5%.

        圖2 凈化體系中PH3去除效率

        抗霉素A抑制電子從細胞色素b到細胞色素c1的傳遞過程[15-16],而魚藤酮則能阻斷電子從NADH向CoQ的傳遞[17-18].添加抗霉素A或魚藤酮至生物反應器內吸收混合液中,R1與R2生物體系的PH3凈化效果已經(jīng)受到不同程度的抑制,而這種抑制作用與凈化體系微生物代謝、酶活性變化的內在關聯(lián),將在本文后續(xù)章節(jié)加以分析.

        2.2 微生物生長與代謝

        生物凈化試驗開始啟動時,各反應器內混合液懸浮固體物濃度(MLSS)為1820mg/L,OD600值為1.08,pH值為7.0.隨著生物凈化過程的推進,R0、R1和R2生物反應器OD600均有所降低;運行時間15~17d期間,3個反應器內OD600處于0.85~0.90這一較為穩(wěn)定的水平;相比而言,沒有添加外源抑制劑的R0反應器OD600略高于R1與R2生物凈化體系(圖3a).以上結果表明:PH3生物凈化體系中,其生物量通常不會太高;當呼吸鏈電子傳遞抑制劑添加至吸收混合液后,凈化系統(tǒng)OD600呈現(xiàn)更低的水平,PH3去除率也明顯偏低(圖2).

        空白方框代表pH值的基準值為7

        實驗過程中,混合吸收液每隔24h調整pH值至7.0以維持適宜的微生物生長環(huán)境.吸收體系在運行過程中pH值均會有所下降;運行時間12~17d期間,R0、R1、R2這3個生物反應器OD600并沒有明顯降低,但每天排放的廢棄液pH值均維持在酸性條件,其平均值分別為4.7, 5.3, 5.4,反映出生化體系酸堿度與碳源代謝及利用密切相關.相比R1與R2兩個生物凈化體系,R0反應器內pH值通常處于較低水平,這一結果與其PH3去除效果相對較高正好吻合,其內在原因為:不添加抑制劑的凈化體系微生物活性相對較好,碳源代謝也更為明顯.

        2.3 磷形態(tài)及濃度變化

        本研究考察了3個生物反應器中STP以及上清液中TP、Ortho-P含量變化,以分析PH3生物凈化體系磷的遷移轉化規(guī)律.各反應器運行一段時間后,吸收體系中STP、上清液中TP與Ortho-P逐步趨于穩(wěn)定. 14~17d期間,R0、R1、R2三個反應器中STP平均值分別為11.1, 12.4, 12.9mg/L;與此相對應,3個反應器內TP分別為0.65, 0.72, 0.77mg/L,其Ortho-P為0.29, 0.04, 0.17mg/L.

        生物凈化體系磷的凈增加量(net)可描述為:

        式中:1和2分別為每天加入的液體培養(yǎng)基體積、廢棄吸收液體積,均為250mL;cul為液體培養(yǎng)基中TP濃度,根據(jù)本文1.1節(jié)液體培養(yǎng)基主要組分可知,cul為6.8mg/L;為入口混合氣流量,200mL/min;為每次廢棄吸收液并加入等體積培養(yǎng)基后的持續(xù)吸收時間,可視為24h;PH3(mg/m3)為入口混合氣中PH3濃度;為PH3凈化效率;dis為每天廢棄的吸收混合液中總磷濃度.

        盡管沒有添加抑制劑的R0反應器PH3去除率相對稍高,理論上從氣相轉入吸收體系的磷含量會稍有上升,但該體系OD600值相對稍高(圖3),每天從反應器混合液中排出的磷含量因而高于另外2個凈化體系,從而導致R0反應器內STP反而最低(圖4a). 連續(xù)運行14d后,各反應體系上清液中TP濃度通常低于0.9mg/L,這就反映出上清液中磷最終可被微生物同化利用而轉入生物體內;相比而言,生物吸收體系中正磷酸鹽濃度維持在較低水平,一般不超過0.35mg/L,這與PH3生物凈化體系中能檢測到次磷酸鹽、亞磷酸鹽的前期研究發(fā)現(xiàn)[19]正好吻合.

        2.4 氧化脅迫與酶活性

        2.4.1 自由基及氧化脅迫 R0、R1和R2生物反應器內微生物體O2-?含量在運行時間11d前波動較為明顯,14~17d期間保持較為穩(wěn)定水平,其平均值分別為0.26, 0.68, 0.96mmol/g. 在添加電子傳遞抑制劑抗霉素A與魚藤酮后,R1與R2生物凈化體系O2-?含量明顯更高(圖5a),其氧化脅迫作用將更為明顯. 與此相對應,這兩個生物體系中MDA含量相對稍高,且R2反應器內MDA含量在3個反應體系中處于最高水平(圖5b),與該反應體系呈現(xiàn)高活性氧(ROS)、低PH3去除率(圖2)正好相一致.

        采用EPR儀測試運行15d條件下各生物凈化體系中自由基生成情況.從圖6可以看出,3個PH3凈化體系中均可檢測到活性氧HO?以及O2-?或其他環(huán)境持久性自由基[20]存在,且添加抑制劑的R1和R2生物反應器中ROS強度明顯高于對照組R0. PH3本身具有一定的生物毒性,其生物凈化體系添加抗霉素A或魚藤酮后,有機底物代謝過程的電子傳遞受到更進一步的抑制,ROS累積現(xiàn)象更為明顯. ROS可以攻擊細胞膜上的多不飽和脂肪酸并導致脂質結構過度氧化[21],其典型產物MDA含量相對更高,這也將明顯抑制PH3的生物凈化效果.

        1-HO?特征峰;2-EPFRs特征峰(包括O2-?)

        2.4.2 氧化酶活性 從不同生物反應器中氧化酶活性(圖7)可以看出,凈化體系運行較為穩(wěn)定時,添加抗霉素A或魚藤酮抑制劑的R1與R2反應器SOD酶活性略低于R0對照組,但其CATase活性卻相對較高. 14~17d期間,R0、R1與R2生物反應器內SOD酶活性平均值分別為185.4, 165.6, 141.1U/ g,其相應的CATase活性平均值分別為25.1, 37.7, 48.0U/g. R0反應器中微生物體內O2-?累積本身并不十分明顯(圖5a),但SOD酶活性相對稍高,活性氧對生物體的氧化脅迫作用得以減弱,這也反映出生物凈化體系在受到PH3生物毒性[22]后具有一定的自我調控功能.

        生物體內O2-?在SOD酶作用下可分解為H2O2;而H2O2也會引發(fā)生成自由基HO?,對胞內物質同樣具有較強的氧化作用,只有在CATase活性也得以增強的條件下,H2O2最終分解為O2與H2O,這種氧化脅迫作用才會得以緩解.添加抑制劑的R1與R2反應體系O2-?含量相對較高,但SOD酶活性卻并沒有相應顯著增加,很明顯,由O2-?導致的生物體胞內物質過度氧化會更為明顯.圖6b也表明,R1與R2這2個體系中CATase活性相比空白對照組均有所提升,有利于促進O2-?代謝產物H2O2的進一步分解,從而減輕自由基HO?對微生物體的不利影響.以上研究結果表明:微生物體內活性氧的類型及其濃度均會直接影響PH3生物凈化效果.

        3 凈化過程的抑制因子及作用途徑

        生化反應取決于各種酶的活性,而金屬陽離子對其具有重要作用,運行時間第15d時3個生物反應器上清液中金屬離子濃度比較如表1所示. 相比每天置換而添加的液體培養(yǎng)基,PH3生物凈化體系上清液中Fe3+、Cu2+、Mn4+、Mg2+這4種離子的濃度均有所降低,尤其以Fe3+、Mg2+兩類離子下降程度更為顯著;相反,生物凈化體系中K+離子濃度略微升高,而Na+離子濃度明顯高于液體培養(yǎng)基. 添加抗霉素A或魚藤酮后,R1與R2生物反應器中上清液Fe3+濃度高于空白對照組,但Cu2+、Mn4+離子濃度反而相對較低.以上研究結果表明:不同類型的金屬離子與PH3生物凈化效果密切關聯(lián).

        表1 生物凈化體系上清液中金屬離子濃度(mg/L)

        基于生物化學基本原理與本研究試驗結果,PH3生物凈化體系潛在的抑制因子及作用途徑如圖8所示.對于PH3生物凈化體系,C6H12O6為微生物生長提供碳源物質,有機底物經(jīng)TCA循環(huán)最終轉化為CO2與H2O,該過程同時伴隨著質子、電子的傳遞與產能代謝.當代謝過程電子傳遞受到明顯抑制時,生物體系對碳源-葡萄糖的分解代謝作用也有所下降,酸累積的現(xiàn)象得以適當緩解,R1與R2兩個吸收體系在置換吸收液1/8并隨后運行24h時,其pH均稍高于對照組R0反應器(圖3b).由于底物代謝,各反應器微生物混合液pH值降至4.6~6.0,此時細胞外H+通過質子泵機制進入微生物體內,從而導致胞內鉀離子(K+)或鈉離子(Na+)遷移至溶液中,生物體系吸收液中K+、Na+含量明顯高于液體培養(yǎng)基(表1).有毒氣體PH3對微生物存在脅迫作用,引起胞內ROS增加[4];另外,魚藤酮與抗霉素A均會抑制呼吸鏈氫和電子的傳遞,使氧化作用受阻,ATP無法合成;魚藤酮抑制NADH向CoQ的轉化過程(I過程),抗霉素A則抑制細胞色素b到細胞色素c1代謝進程(II過程)[15-16].生物氧化過程中電子傳遞受阻時,累積的活性氧ROS更為明顯(圖5和6),會對微生物細胞膜多不飽和脂肪酸(PUFA)造成過度氧化,生物體內MDA含量相應有所上升.為抵抗活性氧的潛在不利影響,更多的Fe、Cu、Mg等金屬陽離子將遷移轉運至微生物體內(表1),氧化酶活性得以不同程度的增強(圖7),從而緩解由活性物質O2-?或HO?導致的氧化脅迫作用.

        圖8 PH3生物凈化過程的抑制因子及作用途徑

        4 結論

        4.1 PH3生物凈化體系中添加抗霉素A或魚藤酮后,生化代謝進程受到抑制,生物體內活性氧累積更為明顯,MDA含量相對較高,PH3去除效率相應下降.

        4.2 采用生物技術凈化處理低濃度PH3尾氣時,可考慮在凈化過程中添加活性氧清除劑以降低ROS氧化脅迫作用,從而提升PH3生物凈化效能.

        4.3 PH3生物凈化過程中,上清液正磷酸鹽濃度維持在較低水平,PH3經(jīng)生物轉化后更多存儲于微生物體內;碳源代謝導致體系pH值下降,引發(fā)生物體胞內Na+、K+流失并對凈化過程產生不利影響.吸收液pH值環(huán)境、生物體內活性氧累積及氧化酶活性等因素均明顯影響PH3生物凈化效果.

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        Inhibition mechanism of phosphine biological purification system.

        YU Shuo, LIU Shu-gen*, LI Ting

        (Faculty of Environmental Science and Engineering, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China)., 2021,41(5):2219~2225

        Two electron transport inhibitors (rotenone and anti-mycin A) were introduced to phosphine bio-purification systems, then comparative experiments were conducted to investigate the variations of the microbial growth and metabolisms, phosphorus transport and transformation, the production of reactive oxygen species (ROS), and oxidase activities. When rotenone and anti-mycin A were respectively added to R1 and R2 bioreactors, the average O2-? content in these two systems increased to 0.68 and 0.96 mmol/g during the operation time of 14~17 days, which was significantly higher than control group (i.e. R0 reactor). Besides O2-?, another kind of reactive oxygen species, i.e. HO?, was also detected in bio-purification systems. In addition, due to the ROS accumulation, the malondialdehyde (MDA) content in microorganisms kept at a high level, caused the purification efficiency of phosphine less than 75%. The average phosphine removal efficiency in the R1 and R2 bioreactors decreased to 65.1% and 59.5% respectively, after 15~17 days operation. The factors, e.g., pH, ROS, and oxidase activity, had significant effects on phosphine biological purification. As metal cations such as Mg2+and Cu2+migrated into the microbial cells, the enzyme activities of superoxide dismutase and catalase were dramatically improved, which led to the alleviation of the oxidative stress derived from the reactive species such as O2-? and HO?. As the consequence, the purification efficacy of phosphine was improved moderately.

        phosphine;biotransformation;inhibition;reactive oxygen species

        X701

        A

        1000-6923(2021)05-2219-07

        余 碩(1995-),男,四川資陽人,昆明理工大學碩士研究生,主要從事廢物資源化及環(huán)境生物技術方面研究工作.

        2020-09-20

        國家自然科學基金資助項目(51868029)

        *責任作者, 教授, bridgelsg@sina.com

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