石 磊，牛宏澤，姚曉磊，宋瑞高，呂麗華，張春香，張建新，任有蛇

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

動(dòng)物的生長發(fā)育和正常代謝機(jī)能的維持都與飼料營養(yǎng)水平有密切的聯(lián)系[1-2]。生殖機(jī)能同其他機(jī)體生理功能一樣，都需要多種營養(yǎng)物質(zhì)維持，機(jī)體通過為配子發(fā)生、受精、胚胎發(fā)育、妊娠等活動(dòng)提供特定的營養(yǎng)元素來直接或間接調(diào)控動(dòng)物的生殖機(jī)能[3-5]。研究表明，短期限飼不僅可以影響血液中氨基酸、葡萄糖含量和代謝相關(guān)酶類的水平，還能通過調(diào)控雌激素和睪酮水平抑制卵泡發(fā)生[4]。日糧營養(yǎng)水平能通過調(diào)控卵泡中促卵泡素受體(follicle stimu-lating hormone receptor，F(xiàn)SHR)和黃體生成素受體(luteinizing hormone receptor，LHR)的表達(dá)來影響卵泡的發(fā)育[6]。生產(chǎn)中也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)，體況差的雌性動(dòng)物通常表現(xiàn)出不發(fā)情、不排卵和受胎率降低等一系列繁殖障礙。對(duì)于雄性動(dòng)物，旺盛的性欲和良好的精液品質(zhì)是保障母畜受胎率的關(guān)鍵，日糧營養(yǎng)就顯得尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)水平可以影響動(dòng)物睪丸的發(fā)育和精子發(fā)生，營養(yǎng)低下會(huì)降低公畜睪丸重量和精子細(xì)胞的數(shù)量，從而導(dǎo)致精子活力差、密度低和睪酮水平下降[7-8]。這說明營養(yǎng)水平不但能通過調(diào)控代謝機(jī)能影響動(dòng)物的體況，還能通過下丘腦-垂體-性腺軸的相應(yīng)受體作用于生殖系統(tǒng)，進(jìn)而影響動(dòng)物的生殖機(jī)能。

雄性動(dòng)物生殖系統(tǒng)發(fā)育和正常生精機(jī)能的維持主要依靠雄激素，雄激素以睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌的睪酮(testosterone，T)為主。睪酮是以膽固醇為原料，在類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein，StAR)的調(diào)控下經(jīng)細(xì)胞色素P450家族成員11A1(cytochrome P450 family 11 subfamily A member 1，CYP11A1)裂解其側(cè)鏈成為孕烯醇酮，然后由3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD)轉(zhuǎn)化為孕酮，孕酮在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)由細(xì)胞色素P450單加氧酶(cytochrome P450 steroid 17-α-monooxygenase，CYP17A1)催化轉(zhuǎn)變?yōu)槊摎浔硇弁蟠x為睪酮[9]。與靶細(xì)胞內(nèi)雄激素受體(androgen receptor，AR)的特異性結(jié)合是睪酮發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵[10-11]。研究者對(duì)AR的結(jié)構(gòu)、功能和定位進(jìn)行了大量研究，但目前，AR在不同種類雄性動(dòng)物生殖器官中的表達(dá)部位仍然存在較大爭議[12-14]。與其他固醇類激素受體類似，AR是一種具有配體活性的轉(zhuǎn)錄因子，一旦被雄激素激活便能識(shí)別靶基因上的雄激素反應(yīng)元件(androgen response element，ARE)并與之結(jié)合，ARE主要位于目的基因附近，通過結(jié)合目的基因的啟動(dòng)子或沉默子來增強(qiáng)或抑制靶基因轉(zhuǎn)錄，最終使細(xì)胞的功能發(fā)生改變[15]。目前，關(guān)于營養(yǎng)對(duì)動(dòng)物繁殖性能影響的研究主要側(cè)重于母畜發(fā)情[16-17]、胚胎發(fā)育[18]及初生仔畜成活率[19]等方面，對(duì)雄性動(dòng)物繁殖性能的影響主要集中在精液品質(zhì)方面[20-22]，關(guān)于睪酮合成及其作用機(jī)理等方面的研究相對(duì)較少。

本試驗(yàn)以杜泊羊(♂)×?xí)x中綿羊(♀)雜交F1代公羔為研究對(duì)象，通過采食量調(diào)控羔羊營養(yǎng)水平，研究不同飼喂水平對(duì)綿羊睪丸發(fā)育、T水平及T合成相關(guān)基因及AR表達(dá)的影響，同時(shí)對(duì)AR在綿羊睪丸組織中的定位進(jìn)行了研究，以期為通過營養(yǎng)水平調(diào)控綿羊繁殖性能，充分發(fā)揮其生殖潛力提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)動(dòng)物

本研究采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，將18只體況良好和體重相近((35±0.5) kg)的杜泊羊(♂)×?xí)x中綿羊(♀)F1代雜交4月齡公羔隨機(jī)分為3組，每組6只。以平均日增重為目標(biāo)，根據(jù)綿羊采食量的標(biāo)準(zhǔn)，分別按自由采食(AL組)、自由采食量的65%(AL65組)和自由采食量的40%(AL40組)3個(gè)飼喂水平投喂全混合顆粒飼料。AL40組為維持采食量組，其平均日增重為0 g·d-1，AL65組日增重維持在150 g·d-1，AL組日增重維持在300 g·d-1。當(dāng)AL組任意1只綿羊的體重達(dá)到50 kg時(shí)全部進(jìn)行屠宰。

1.2 主要試劑

Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購自TaKaRa公司；Rabbit Anti-AR 和Rabbit Anti-β-actin多克隆一抗、HRP標(biāo)記的Goat Aniti-Rabbit二抗，DAB、即用型SABC免疫組化試劑盒等均購自武漢博士徳公司；BSA、NC膜、SDS-PAGE制膠試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、Marker等均購自索萊寶公司；綿羊睪酮ELISA試劑盒購于上海藍(lán)基生物公司；其他常用試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)日糧

本研究的試驗(yàn)日糧配方參考NRC(2007)綿羊營養(yǎng)需要量配制全混合顆粒飼料。試驗(yàn)日糧的組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗(yàn)日糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the experimental diet (DM basis) %

1.4 羔羊飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)羊只采用全舍飼單欄飼養(yǎng)，預(yù)飼期10 d，正飼期55 d。預(yù)飼前打耳號(hào)、驅(qū)蟲、免疫，使其適應(yīng)試驗(yàn)日糧，進(jìn)入正飼期后，嚴(yán)格按照配方要求提供顆粒飼料。掌握其采食情況，并適當(dāng)調(diào)整體重，使其盡可能一致。根據(jù)預(yù)飼期的采食量確定AL組日飼喂量。每日記錄個(gè)體采食量，并在晨飼前清除飼槽內(nèi)剩料，記錄剩料量，保證自由采食組剩料量約為飼喂量的10%，并根據(jù)AL組的采食量確定AL65組和AL40組的日飼喂量。每日于08:00和18:00兩次飼喂，自由飲水，圈舍溫度維持在合理的范圍內(nèi)。當(dāng)AL組中任意1只綿羊體重達(dá)到50 kg時(shí)，飼喂試驗(yàn)結(jié)束。

1.5 睪丸樣品采集

飼喂試驗(yàn)結(jié)束后，手術(shù)法摘取綿羊睪丸，分別測定睪丸的周徑與長度；采集的睪丸組織分為兩部分：一部分切成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的組織塊，4%多聚甲醛固定；另一部分用錫紙包好后放入凍存管，立即投入液氮保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 試驗(yàn)方法

1.6.1 睪丸組織切片觀察 常規(guī)方法制作睪丸組織的石蠟切片，經(jīng)過H-E染色后在顯微鏡(Olympus BX53，Japan)下觀察，每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)不同的視野，使用Image-Pro Plus 7.0軟件測定曲精細(xì)管直徑、生精上皮厚度和生精細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞密度。

1.6.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測基因表達(dá)情況 使用Trizol法提取綿羊睪丸組織的總RNA，用核酸蛋白測定儀(ND-1000，NanoDrop)進(jìn)行質(zhì)檢后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)NCBI提供的綿羊睪酮合成基因(STAR、3β-HSD、CYP11A1和CYP17A1)、AR和18S的mRNA序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表2)，由上海生工生物工程公司合成。擴(kuò)增操作按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒建議的反應(yīng)條件，構(gòu)建反應(yīng)體系，總體系為20 μL：SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，正、反向引物各0.8 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 7.4 μL，每個(gè)樣本3次重復(fù)。

表2 熒光定量PCR的引物Table 2 Primer sequences used for qRT-PCR in this study

1.6.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定睪酮(T)水平 將不同處理的睪丸組織進(jìn)行勻漿，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行。通過測定6個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值和對(duì)應(yīng)的OD值，使用四參數(shù)Logistics曲線擬合法，橫坐標(biāo)為T濃度，縱坐標(biāo)為OD值，擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程，結(jié)合各待測樣品的OD值，計(jì)算出各個(gè)樣品的T濃度。

1.6.4 蛋白免疫印跡法分析雄激素受體(AR)豐度 提取綿羊睪丸組織的總蛋白并測定蛋白濃度，然后進(jìn)行Western blotting 檢測。蛋白上樣量為60 μg，SDS-PAGE電泳采用5%濃縮膠80 V 30 min，10%分離膠120 V 1.5 h，轉(zhuǎn)膜條件為100 V 1.5 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育Rabbit Anti-AR(1∶200)和Rabbit Anti-β-actin(1∶400)多克隆一抗，4 ℃過夜，TBST洗3次，每次10 min，Goat Anti-Rabbit(1∶1 000) 二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，ECL曝光后觀察并拍照。

1.6.5 雄激素受體(AR)的免疫組織化學(xué)定位分析 取睪丸組織切片，常規(guī)方法脫蠟至水，滴加3% H2O2，37 ℃ 10 min；PBS沖洗3次，各3 min；檸檬酸緩沖液98 ℃抗原修復(fù)，待冷卻至室溫；5%BSA室溫封閉 30 min；滴加Rabbit Anti-AR一抗(1∶200)4 ℃過夜后PBS洗3次，加HRP標(biāo)記二抗37 ℃ 30 min；同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，一抗用PBS代替。Olympus生物顯微鏡(BX53)觀察，并使用Image-Pro plus 7.0軟件拍照。

1.7 數(shù)據(jù)處理

qRT-PCR數(shù)據(jù)使用2-△△CT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。用Image J軟件對(duì)免疫印跡條帶的灰度值進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件使用單因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan’s法進(jìn)行多重比較，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)”。

2 結(jié) 果

2.1 不同飼喂水平對(duì)綿羊睪丸發(fā)育的影響

不同飼喂水平對(duì)綿羊睪丸發(fā)育的分析結(jié)果如表3所示，綿羊睪丸的周徑與長度隨著飼喂水平的提高而升高，其中，AL組顯著(P<0.05)高于AL40組，但與AL65組間差異不顯著(P>0.05)。對(duì)綿羊睪丸組織結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)(圖1)，AL組睪丸曲精細(xì)管生精上皮厚度顯著高于限飼組(P<0.05)，但AL40和AL65組間差異不顯著(P>0.05)，不同營養(yǎng)水平對(duì)綿羊睪丸曲精細(xì)管直徑無明顯影響(P>0.05)。曲精細(xì)管中均可觀察到各級(jí)生精細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，隨著飼喂水平的提高，生精細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的密度顯著增加(P<0.05)。

表3 不同飼喂水平條件下綿羊睪丸發(fā)育的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)參數(shù)Table 3 Testicular morphological and histological parameters of sheep under different feeding levels

A.AL40組；B.AL65組；C.AL組A.AL40 group;B.AL65 group;C.AL group圖1 不同飼喂水平條件下綿羊睪丸組織H-E染色結(jié)果(400×)Fig.1 H-E staining results of testis in sheep under different feeding levels(400×)

2.2 不同飼喂水平對(duì)綿羊睪丸睪酮分泌和睪酮合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

如圖2所示，AL40組綿羊睪丸組織中T水平最低，隨著飼喂水平的提高，睪丸組織中的T水平顯著提高(P<0.05)。通過對(duì)睪丸組織T合成相關(guān)基因表達(dá)的分析(圖3)發(fā)現(xiàn)，AL組中STAR和3β-HSD基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于限飼組(P<0.05)，其表達(dá)情況與睪丸組織T水平的變化一致。AL組中CYP17A1和CYP11A1基因也均呈現(xiàn)高表達(dá)，且顯著高于AL40組(P<0.05)；AL65和AL40組間CYP17DA1和CYP11A1基因的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，下同Different letters mean significant difference (P<0.05),same letter means no significant difference (P>0.05),the same as below圖2 不同飼喂水平綿羊睪丸組織中的睪酮含量Fig.2 Testosterone content in testis of sheep under different feeding levels

圖3 不同飼喂水平下睪酮合成相關(guān)基因在綿羊睪丸中的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression level of T synthesis-related genes in the testis of sheep under different feeding levels

2.3 不同飼喂水平對(duì)綿羊睪丸組織AR mRNA和蛋白表達(dá)的影響

由圖4可知，AL40組睪丸組織中ARmRNA的相對(duì)表達(dá)量(圖4A)最低，隨著飼喂水平的提高而顯著提高(P<0.05)。AR蛋白豐度(圖4B)與mRNA的表達(dá)情況基本一致，即AL組>AL65組>AL40組。

圖4 不同飼喂水平下AR mRNA和蛋白在綿羊睪丸中表達(dá)量Fig.4 The expression of AR mRNA and protein in the testis of sheep under different feeding levels

2.4 綿羊睪丸中AR蛋白的定位

AR蛋白在綿羊睪丸組織中定位的結(jié)果如圖5所示，曲精細(xì)管中部分精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞和精子細(xì)胞可以檢測到陽性信號(hào)，睪丸間質(zhì)細(xì)胞、管壁肌樣細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞均可檢測到AR陽性信號(hào)。

A.間質(zhì)細(xì)胞和曲精細(xì)管的生精細(xì)胞；B.間隙中的血管和曲精細(xì)管的生精上皮。Sg.精原細(xì)胞；PS.初級(jí)精母細(xì)胞；St.精子細(xì)胞；LC.間質(zhì)細(xì)胞；PMC.曲精細(xì)管管周肌樣細(xì)胞；BV.間質(zhì)血管平滑肌細(xì)胞A.Leydig cells and spermatogenic cells;B.Interstitial blood vessel and the germinal epithelium of seminiferous tubule.Sg.Spermatogonia;PS.Primary spermatocytes;St.Spermatid;LC.Leydig cells;PMC.Peritubular myoid cells;BV.Smooth muscle cells of interstitial blood vessel圖5 AR在綿羊睪丸組織中的免疫組化定位 (400×)Fig.5 Localization of AR in testis of sheep using immunohistochemistry (400×)

3 討 論

生殖器官指數(shù)能夠在一定程度上反映動(dòng)物機(jī)體的生殖機(jī)能狀況[23]。本試驗(yàn)首先檢測了不同飼喂水平下羔羊睪丸的整體發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)AL組綿羊睪丸的周徑與長度顯著高于AL40組。由于所用試驗(yàn)動(dòng)物初始體況基本一致，綿羊睪丸的周徑和長度出現(xiàn)的差異應(yīng)是由于不同營養(yǎng)水平導(dǎo)致的，這說明飼喂水平對(duì)羔羊睪丸的生長發(fā)育有一定的影響。Pang等[24]的研究也發(fā)現(xiàn)，30%的能量限制對(duì)綿羊睪丸的發(fā)育有明顯影響，造成了睪丸重量和生精細(xì)胞數(shù)量下降。然而，在本研究中，AL65組和AL組綿羊睪丸的周徑與長度差異不顯著，這說明日糧飼喂水平在基本滿足動(dòng)物機(jī)體基本營養(yǎng)需要的情況下，繼續(xù)提高營養(yǎng)水平并不能顯著促進(jìn)綿羊睪丸的生長發(fā)育，這與前人在綿羊上的研究結(jié)果基本一致[23-26]。此外，從睪丸組織形態(tài)學(xué)分析的結(jié)果可以看出，隨著營養(yǎng)水平的降低，曲精細(xì)管生精上皮厚度明顯下降，生精細(xì)胞的數(shù)量也逐漸減少，再次說明不同飼喂水平能影響動(dòng)物睪丸的發(fā)育。然而，本試驗(yàn)中不同處理組間綿羊睪丸曲精細(xì)管的直徑差異并不顯著。Glass等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，低蛋白日糧可造成大鼠睪丸和前列腺的重量下降，但曲精細(xì)管直徑未發(fā)生明顯改變。課題組前期在山羊上的研究也觀察到，睪丸曲精細(xì)管的直徑未受到日糧中添加微量元素的影響[28]。這說明曲精細(xì)管的直徑可能與該物種本身有關(guān)。

在動(dòng)物生殖器官的發(fā)育過程中，生殖激素起著最重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼喂水平的提高，T的分泌量也逐漸增加。這說明飼喂水平能夠影響生殖激素的分泌。李碧波等[8]發(fā)現(xiàn)，日糧營養(yǎng)水平對(duì)山羊血清中的睪酮含量影響極顯著，提高能量水平能提高動(dòng)物的射精量、精子密度和有效精子數(shù)。在綿羊上的研究還發(fā)現(xiàn)，提高能量水平可通過提高公羊促性腺激素LH和FSH的合成與釋放促進(jìn)睪酮的分泌，從而提高動(dòng)物的精液品質(zhì)和繁殖性能[29]。動(dòng)物的睪酮主要是由睪丸的間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌，本研究中睪丸組織T水平的變化與間質(zhì)細(xì)胞密度的分析結(jié)果一致，提示，日糧營養(yǎng)水平可以通過改變生殖內(nèi)分泌來影響睪丸發(fā)育，而這可能與營養(yǎng)水平調(diào)控間質(zhì)細(xì)胞的增殖有關(guān)，但也不能排除營養(yǎng)水平可以影響睪酮合成的可能性，因此，其確切機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。為此，本試驗(yàn)通過qRT-PCR方法對(duì)睪酮合成相關(guān)基因STAR、3β-HSD、CYP11A1和CYP17A1的表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AL組的高營養(yǎng)水平顯著增強(qiáng)了這些基因的表達(dá)。這說明營養(yǎng)水平可以影響間質(zhì)細(xì)胞中睪酮合成基因的表達(dá)，從而提高睪丸組織中的睪酮水平。這些結(jié)果表明，營養(yǎng)水平對(duì)于雄性生殖機(jī)能的調(diào)控是多方面的，營養(yǎng)物質(zhì)在促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞增殖的同時(shí)，還促進(jìn)睪酮合成基因的表達(dá)。這也從另外一方面體現(xiàn)了營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體發(fā)育和生理功能調(diào)控的復(fù)雜性。

雄激素與靶細(xì)胞上對(duì)應(yīng)的雄激素受體特異性結(jié)合才能發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[10-11]。馬瑞等[30]通過在大鼠血管平滑肌細(xì)胞中添加不同濃度的T，發(fā)現(xiàn)一定濃度的T能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖，同時(shí)AR表達(dá)水平也得到了上調(diào)。最近，在山羊睪丸上皮細(xì)胞和小鼠支持細(xì)胞上的研究也發(fā)現(xiàn)，T能顯著增強(qiáng)細(xì)胞中AR的表達(dá)[31-33]。提示，睪丸中T作用的發(fā)揮與AR的表達(dá)水平有著必然的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，T不僅可以影響AR的表達(dá)，還能通過結(jié)合AR激活下游信號(hào)通路中精子發(fā)生關(guān)鍵信號(hào)分子的表達(dá)，從而調(diào)控動(dòng)物的生精機(jī)能[33]?？梢酝茰y，營養(yǎng)水平不同造成睪丸中T的差異勢必會(huì)引起AR表達(dá)水平的變化，這樣才能充分發(fā)揮睪酮的生殖調(diào)控功能。因此，本試驗(yàn)采用qRT-PCR和Western blotting的方法研究了AR mRNA和蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AR蛋白表達(dá)規(guī)律與mRNA豐度趨勢基本一致，隨著飼喂水平的提高，其表達(dá)量也相應(yīng)的提高。這說明，飼喂水平可能通過改變睪丸AR的表達(dá)，發(fā)揮T對(duì)睪丸生精上皮發(fā)育和精子發(fā)生過程的調(diào)節(jié)作用，從而影響動(dòng)物的生殖機(jī)能。Genovese等[34]在大鼠上的研究發(fā)現(xiàn)，限飼能顯著降低睪丸中AR的表達(dá)。另外，在卵巢上的研究也表明，飼喂水平通過改變LHR和FSHR的表達(dá)量促進(jìn)FSH和LH對(duì)卵泡的發(fā)育調(diào)節(jié)作用[4,6,35]。這充分說明，飼喂水平能夠調(diào)節(jié)生殖激素相關(guān)受體表達(dá)水平，從而影響動(dòng)物配子發(fā)生與生殖器官發(fā)育。

目前，AR在不同種類雄性生殖器官中的表達(dá)部位仍然存在爭議。本研究同時(shí)采用免疫組化的方法對(duì)綿羊睪丸中AR進(jìn)行了定位分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AR在精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)。這與李振等[36]的研究結(jié)果一致。Ge等[37]的研究發(fā)現(xiàn)，AR在綿羊睪丸中呈現(xiàn)高表達(dá)，主要在附睪上皮、基膜、平滑肌、間質(zhì)細(xì)胞和精子中檢測到了AR陽性產(chǎn)物。在山羊上的研究也發(fā)現(xiàn)，AR在間質(zhì)細(xì)胞中呈現(xiàn)高密度強(qiáng)陽性表達(dá)，在各級(jí)生精細(xì)胞中呈現(xiàn)中等強(qiáng)度的陽性表達(dá)[38]。這說明，AR對(duì)雄性動(dòng)物生殖機(jī)能發(fā)育和精子發(fā)生具有重要作用。然而，通過對(duì)曲精細(xì)管生精上皮不同生精細(xì)胞的觀察發(fā)現(xiàn)，有些生精細(xì)胞不表達(dá)AR或呈現(xiàn)弱陽性表達(dá)，這說明AR在生精細(xì)胞中的表達(dá)有一定階段性，可能與精子發(fā)生過程中生精細(xì)胞所處的時(shí)期有關(guān)，生精細(xì)胞可能只有在增殖和分化的特定時(shí)期才會(huì)受到雄激素的調(diào)控，AR也在這一階段豐度增加來結(jié)合雄激素，從而調(diào)控生精細(xì)胞的生理活動(dòng)。當(dāng)其沒有表達(dá)AR或AR豐度太低時(shí)，說明這些細(xì)胞對(duì)T的敏感性較差，不具備增殖或向下一級(jí)生精細(xì)胞分化的條件，其中部分生精細(xì)胞可能會(huì)凋亡。AR在間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，說明T對(duì)間質(zhì)細(xì)胞的功能可能存在自反饋調(diào)節(jié)，AR在間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)于確保間質(zhì)細(xì)胞的增殖和T分泌功能是非常必要的[39-41]。AR的表達(dá)在曲精細(xì)管管壁肌樣細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中并沒有表現(xiàn)出階段性，這些部位是血睪屏障的重要組成部分，AR的持續(xù)高水平表達(dá)可能與T的轉(zhuǎn)運(yùn)和釋放有關(guān)。

此外，T的合成與分泌受下丘腦-垂體-睪丸軸調(diào)控，其中經(jīng)典的分子信號(hào)通路是黃體生成素(LH)-黃體生成素受體(LHR)-環(huán)磷酸腺苷(cAMP)-蛋白激酶A(PKA)途徑。因此，營養(yǎng)水平是如何通過影響T合成與分泌以及AR的表達(dá)來調(diào)控睪丸發(fā)育和精子的發(fā)生過程，仍然需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

較低的飼喂水平抑制了綿羊睪丸發(fā)育，降低了曲精細(xì)管生精上皮厚度、生精細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞密度。T合成相關(guān)基因和AR的表達(dá)量隨飼喂水平的提高而增加，且與睪酮的變化趨勢一致。AR在綿羊睪丸精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)。