羅 焱 張 平 （南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，衡陽421002）

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是一種由多原因所致腦表面或底部腦血管破裂后血液流入蛛網(wǎng)膜下腔而引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。SAH后可出現(xiàn)多種嚴(yán)重并發(fā)癥，如早期腦損傷（early brain injury，EBI）、急性腦血管痙攣、血腦屏障、遲發(fā)性腦缺血等，且還具有較高的發(fā)病率、致殘率和致死率［1-2］。既往研究認(rèn)為，EBI是導(dǎo)致SAH患者死亡和不良預(yù)后的重要原因，而神經(jīng)元凋亡則被認(rèn)為是引起EBI的重要病理機制［3-5］。此外，作為真核生物中高度保守的一類生物學(xué)途徑，自噬可通過降解細(xì)胞內(nèi)組分維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，在感染、癌癥、神經(jīng)退行性變、衰老和代謝紊亂相關(guān)的多種疾病中起著關(guān)鍵作用。既往研究表明，SAH后的自噬激活對EBI具有神經(jīng)元保護(hù)作用［6-7］。姜黃素（curcumin，Cur）是一種從姜黃中分離出的天然二酮類化合物，具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多重藥理學(xué)作用。多項研究表明，Cur是一種天然的自噬調(diào)節(jié)劑，能夠通過激活自噬抑制細(xì)胞凋亡［8-9］。同時，已證實Cur對SAH后腦血管痙攣、EBI、血腦屏障等具有神經(jīng)保護(hù)作用［10-12］。然而，Cur是否通過激活自噬發(fā)揮SAH后神經(jīng)保護(hù)作用，目前鮮有報道。因此，本研究擬采用血管內(nèi)穿刺法建立大鼠SAH模型，探究Cur對SAH后神經(jīng)元凋亡及自噬的影響，并初步闡明其機制，旨在為臨床中藥防治SAH后神經(jīng)損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，鼠齡7～8周，體重250～300 g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，動物飼養(yǎng)合格證號：SCXK（湘）2014-0011。

1.1.2 主要試劑 姜黃素（純度99%）購自河南科銳化工有限公司；AMPK抑制劑Dorsomorphin購自美國Med Chem Express公司；TUNEL染色試劑盒購自上海碧云天生物工程有限公司；兔抗cleaved-cas‐pase-3多克隆抗體、兔抗Beclin-1單克隆抗體、小鼠抗LC3-Ⅱ多克隆抗體、兔抗Phospho-AMPKα（Thr 172）單克隆抗體、兔抗AMPKα單克隆抗體、兔抗Phospho-mTOR（Ser2448）單克隆抗體、兔抗mTOR多克隆抗體、兔抗GAPDH單克隆抗體、熒光二抗Goat Anti-Mouse IgG H&L（Alexa Fluor?488）以及Goat Anti-Rabbit IgGH&L（Alexa Fluor?594）均購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗NeuN熒光單克隆抗體（Alexa Fluor?594 Conjugate）購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔、小鼠IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型構(gòu)建 將60只SD雄性大鼠隨機分成5組，假手術(shù)組（Sham）、模型組（SAH），Cur低劑量干預(yù)組（50 mg/kg，Cur-L）、Cur高劑量干預(yù)組（200 mg/kg，Cur-H）和高劑量Cur聯(lián)合AMPK抑制劑Dorsomorphin干預(yù)組（200 mg/kg Cur+25 mg/kg Dorsomorphin，Cur-H+Dor），每組12只。采用血管內(nèi)穿刺法建立大鼠SAH模型，以穿刺后有明確無腦實質(zhì)損害的SAH或血凝塊作為模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)［13］。其中Sham組不刺破血管壁，其余操作均一致。術(shù)后Cur干預(yù)組立即給予側(cè)腦室注射給藥，Cur-H+Dor組在Cur給藥結(jié)束后給予側(cè)腦室注射25 mg/kg Dorsomorphin，Sham與SAH組給予注射等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)3 d。

1.2.2 大鼠神經(jīng)功能缺損評分及腦含水量檢測 給藥治療3 d后，參考YAMAGUCHI等［14］方法對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)損傷缺損評分，總分24分，神經(jīng)功能缺失越嚴(yán)重得分就越低，具體評分項目包括：①自主運動；②肢體本能反應(yīng)；③觸須反應(yīng)；④前爪的伸展性；⑤攀爬運動能力；⑥四肢運動的平衡性。各組隨機抽取5只大鼠，斷頭處死后取腦組織，使用濾紙將缺血側(cè)腦組織表面水分小心擦拭，稱其濕重后將其置于100℃烘箱內(nèi)烘烤至恒重，然后稱其干重，計算各組大鼠腦組織含水量。腦組織含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.2.3 TUNEL法檢測海馬組織神經(jīng)元凋亡情況取各組1.2.2后剩余大鼠，于術(shù)后3 d斷頭取腦并分離海馬組織，取部分海馬組織經(jīng)4%多聚甲醛固定過夜，石蠟包埋后切片、脫蠟，滴加不含DNase的蛋白酶K在37℃條件下孵育15 min，用PBS洗滌3次，再滴加3%過氧化氫溶液室溫孵育10 min，用PBS洗滌3次，按要求滴加生物素標(biāo)記液，37℃孵育60 min，PBS洗滌1次終止反應(yīng)，最后滴加DAB顯色液室溫孵育20 min，蘇木精染色，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者即為凋亡細(xì)胞。每張切片選擇6個高倍鏡視野計數(shù)600個細(xì)胞，凋亡率以600個細(xì)胞中陽性細(xì)胞百分比表示。

1.2.4 免疫熒光染色觀察LC3-Ⅱ在神經(jīng)元中的分布及表達(dá) 取部分已采用4%多聚甲醛固定的海馬組織，放入20%蔗糖溶液中至組織沉到瓶底，包埋后切片，每連續(xù)5片取1片用于組織免疫熒光染色。取出切片，采用10%山羊血清室溫封閉1 h，分別加入兔抗LC3-Ⅱ抗體（1：100）和小鼠抗NeuN抗體（1：50），4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，分別加入二抗Goat Anti-Mouse IgGH&L（Alexa Fluor?488）和Goat Anti-Rabbit IgGH&L（Alexa Fluor?594）室溫避光孵育1 h，PBS洗滌3次，加入防淬滅劑后甘油封片，熒光顯微鏡下觀察，以LC3-Ⅱ蛋白平均熒光強度表示LC3-Ⅱ蛋白顆粒形成水平。

1.2.5 Western blot檢測大鼠腦組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平 取大鼠部分凍存海馬組織，加入RIPA裂解液，冰上充分研磨20 min，4℃條件下12 000/rmin離心20 min，留取上清液，使用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取30μg蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，PBST洗滌3次，分別加入cleaved-cas‐pase-3抗體、Beclin-1抗體、LC3-Ⅱ抗體、p-AMPKα抗體、AMPKα抗體、p-mTOR抗體、mTOR抗體和GAPDH抗體，4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔或小鼠IgG，室溫孵育30 min，PBST洗滌3次，滴加ECL發(fā)光顯影。采用Image J測定蛋白條帶的光密度并進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用±s表示，多組間比較用One Way ANOVA方法，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cur對SAH大鼠神經(jīng)功能及腦組織水腫的影響 與Sham組比較，SAH組大鼠神經(jīng)功能評分顯著降 低（P＜0.001），腦 組 織 含 水 量 顯 著 增 加（P＜0.001）；與SAH組比較，Cur-H組大鼠神經(jīng)功能評分顯著增加（P＜0.001），腦組織含水量顯著降低（P＜0.001），而Cur-L組與SAH組比較無顯著性差異（P＞0.05）；與Cur-H組比較，Cur-H+Dor組大鼠神經(jīng)功能評分顯著降低（P＜0.001），腦組織含水量顯著增加（P＜0.05），如圖1所示。

2.2 Cur對SAH大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡的影響 與Sham組比較，SAH組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率以及海馬組織中cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著增加（P＜0.001）；與SAH組比較，Cur-H組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率以及cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.001），Cur-L組無顯著性差異（P＞0.05）；與Cur-H組比較，Cur-H+Dor組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡率和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著增加（P＜0.001），如圖2、3所示。

2.3 Cur對SAH大鼠海馬組織自噬水平的影響與Sham組比較，SAH組大鼠海馬區(qū)LC3-Ⅱ蛋白熒光信號減弱（P＜0.001），Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05）；與SAH組比較，Cur-H組大鼠海馬區(qū)LC3-Ⅱ蛋白熒光信號增強（P＜0.001），Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.001），而Cur-L組無顯著性變化（P＞0.05）；與Cur-H組比較，Cur-H+Dor組大鼠海馬區(qū)LC3-Ⅱ蛋白熒光信號減弱，Be‐clin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），如圖4、圖5所示。

圖1 各組大鼠神經(jīng)功能評分和腦組織含水量比較Fig.1 Comparison of neurological score and brain water content of rats in each groups

圖2 TUNEL染色（×400）Fig.2 TUNEL staining（×400）

圖3 各組大鼠海馬組織中Cleaved-caspase-3表達(dá)水平Fig.3 Expressions level of Cleaved-caspase-3 in hippo?campal tissues of rats in each group

圖4 各組大鼠海馬組織LC3-Ⅱ蛋白免疫熒光染色（×400）Fig.4 Immunofluorescence staining of LC3-Ⅱprotein in hippocampal tissues of rats in each group（×400）

2.4 Cur對SAH大鼠海馬組織AMPK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與Sham組比較，SAH組大鼠海馬組織p-AMPKα表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），pmTOR表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），與SAH組比較，Cur-H組大鼠海馬組織p-AMPKα表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），而p-mTOR表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），而Cur-L組無顯著性變化（P＞0.05）；與Cur-H組比較，Cur-H+Dor組大鼠海馬組織p-AMPKα表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），同時p-mTOR表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。而各組總AMPKα和mTOR蛋白水平無顯著性變化（P＞0.05），如圖6所示。

圖5 各組大鼠海馬組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.5 Expression level of autophagy related-proteins in hippocampal tissues of rats in each group

圖6 各組大鼠海馬組織中AMPK信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.6 Expression of AMPK signaling pathway related proteins in hippocampal tissues of rats in each group

3 討論

自噬即自我吞噬作用，是真核生物特有的生命現(xiàn)象，機體主要通過自噬溶酶體來清除細(xì)胞內(nèi)的毒性物質(zhì)和受損的細(xì)胞器，執(zhí)行生存或死亡的功能，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。自噬通路在神經(jīng)退行性疾病、腦缺血再灌注損傷、創(chuàng)傷性腦損傷等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用［15-17］。既往研究表明［18］，SAH后神經(jīng)元自噬被激活以抑制神經(jīng)元凋亡，然而這種自噬水平在24 h達(dá)到峰值，隨后降低并在48 h恢復(fù)正常。自噬可以通過清除受損線粒體，抑制細(xì)胞色素

C等凋亡起始因子的釋放，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，是應(yīng)激性細(xì)胞損傷的重要保護(hù)機制。因此，若適當(dāng)激活神經(jīng)元自噬極有可能對SAH后EBI相關(guān)神經(jīng)元凋亡起到抑制作用。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cur干預(yù)可顯著提高SAH大鼠神經(jīng)元自噬水平并抑制神經(jīng)元凋亡，對SAH大鼠神經(jīng)功能及腦組織水腫有顯著的改善作用。表明，Cur可以通過增強自噬抑制SAH后早期神經(jīng)元凋亡。

腦血管破裂后會引起腦血管血流的改變，造成供血區(qū)域出現(xiàn)缺血缺氧狀態(tài)，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，而神經(jīng)元凋亡恰是導(dǎo)致SAH后EBI的重要病理機制。本研究采用血管內(nèi)穿刺法建立SAH大鼠模型發(fā)現(xiàn)，SAH大鼠海馬組織中神經(jīng)元凋亡嚴(yán)重，cleaved-caspase-3表達(dá)水平顯著上調(diào)，且神經(jīng)缺失和腦組織水腫嚴(yán)重。而采用Cur干預(yù)后，SAH大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡率顯著下降，海馬組織cleavedcaspase-3表達(dá)水平顯著降低，神經(jīng)缺失和腦組織水腫改善明顯。李霞等［11］研究顯示，Cur可抑制SAH大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，并改善SAH后EBI。說明，Cur能夠抑制SAH后海馬神經(jīng)元凋亡，改善神經(jīng)功能。然而，有關(guān)Cur抑制SAH后海馬神經(jīng)元凋亡的潛在機制尚不完善。

細(xì)胞凋亡與細(xì)胞自噬之間關(guān)系錯綜復(fù)雜，既相互相成，又相互制約。當(dāng)細(xì)胞受環(huán)境壓力較小時，細(xì)胞啟動自噬機制克服應(yīng)激損傷，避免細(xì)胞死亡；若環(huán)境壓力較大或持續(xù)時間較長時，細(xì)胞自噬將過度消耗細(xì)胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞器而使細(xì)胞無法繼續(xù)生產(chǎn)，繼而啟動凋亡程序并抑制自噬［19］。SAH后短時間內(nèi)神經(jīng)元自噬會被激活，適度自噬有利于毒性物質(zhì)和受損細(xì)胞器的清除，能夠促進(jìn)神經(jīng)元存活，抑制凋亡［6-7，18］。適度激活神經(jīng)元自噬可抑制SAH后早期神經(jīng)元凋亡，而Cur具有激活細(xì)胞自噬的作用，因此，Cur有可能通過調(diào)節(jié)自噬抑制SAH后早期神經(jīng)元凋亡［8-9］。為了進(jìn)一步證實，本研究對自噬標(biāo)志分子LC3-Ⅱ蛋白及自噬啟動因子Beclin-1蛋白進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示Cur干預(yù)后能夠顯著提高SAH大鼠海馬組織中Beclin-1。

mTOR是調(diào)控自噬的關(guān)鍵分子，其激活可抑制自噬，而作為mTOR負(fù)調(diào)控因子，AMPK的激活可促進(jìn)自噬［20］。有報道稱，AMPK信號通路參與了SAH后早期腦損傷中神經(jīng)元自噬的激活［21］。同時也有研究顯示，Cur可通過激活A(yù)MPK信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬［22］。因此，在SAH中Cur極可能通過調(diào)控AMPK/mTOR信號通路誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元自噬。為此，本研究對該通路關(guān)鍵調(diào)控蛋白的磷酸化水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cur可顯著提高SAH大鼠海馬組織中p-AMPK水平，降低p-mTOR水平，而對AMPK和mTOR蛋白表達(dá)水平無顯著影響。說明，Cur是通過激活A(yù)MPK信號通路誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元自噬。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Cur可通過激活A(yù)MPK通路誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元自噬，進(jìn)而抑制神經(jīng)元凋亡，從而改善SAH大鼠神經(jīng)損傷，為Cur防治SAH后神經(jīng)損傷提供了新的實驗依據(jù)。