賀映俠 嚴鳳琴 明小燕 朱 虹 （武漢市中心醫(yī)院全科醫(yī)學科，武漢430000）

血脂異常、糖代謝異常、中心性肥胖、動脈粥樣硬化等是代謝綜合征常見的臨床癥候群，其以胰島素抵抗為中心，這些危險因素可以誘導2型糖尿病的發(fā)生［1］。肝臟是糖代謝的重要部位，肝細胞胰島素抵抗發(fā)生時主要表現(xiàn)為肝糖原合成水平降低等［2］。HepG2細胞來源于肝癌細胞，其表型同肝細胞相似性極高，高濃度的胰島素可以誘導HepG2細胞胰島素抵抗，這也是體外常用的細胞胰島素抵抗模型［3］。紅芪多糖（hedysaryum polysaccharide）是提取自中藥紅芪中的活性成分，其含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖等多種復(fù)雜單糖，有降血壓、抗氧化、降血脂、消炎等功效，紅芪多糖對糖尿病、腫瘤等臨床常見疾病具有明顯的治療作用［4］。研究顯示，紅芪多糖治療后的糖尿病大鼠血糖明顯降低，胰島素敏感性增加［5］。PI3K/AKT是一個在人體內(nèi)廣泛存在的信號通路，參與腫瘤、心血管系統(tǒng)疾病等的發(fā)生［6-7］。研究表明，PI3K/AKT在肝臟胰島素抵抗中激活水平下降，激活PI3K/AKT信號通路可以減輕肝細胞胰島素抵抗水平［8］?，F(xiàn)階段對于紅芪多糖在HepG2細胞胰島素抵抗模型糖代謝以及胰島素敏感性中的作用及機制尚不明確。本次實驗用胰島素誘導HepG2細胞，建立胰島素抵抗模型，探討紅芪多糖的作用和機制，為紅芪多糖治療糖尿病提供理論資料。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2細胞購自深圳市百恩維生物科技有限公司；葡萄糖氧化酶試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司；p-PI3K抗體購自上海鑫樂生物科技有限公司；糖原含量檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；紅芪多糖購自西安天瑞生物技術(shù)有限公司；引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；p-AKT抗體購自上海晅科生物科技有限公司；PI3K/AKT信號抑制劑LY294002購自美國Sigma。

1.2 方法

1.2.1 MTT方法測定HepG2細胞活性 HepG2細胞用含有10%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)置為：37℃，5%CO2、95%空氣、飽和濕度的培養(yǎng)箱。將HepG2細胞按照每個孔內(nèi)加2 000個細胞分別種植到96孔板內(nèi)，過夜培養(yǎng)將孔內(nèi)的上清去除，再加入含有紅芪多糖（終濃度為0、10、20、40、80μg/ml）的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出培養(yǎng)板，依次添加15μl的MTT，結(jié)合4 h后，棄掉孔中液體，添加DMSO，振蕩孵育10 min，經(jīng)空白孔調(diào)零以后，在酶標儀上檢測每個孔的OD值，以0μg/ml紅芪多糖處理的細胞存活率為100%，分析其余各組細胞存活率變化。

1.2.2 細胞分組及構(gòu)建HepG2細胞胰島素抵抗模型 HepG2細胞胰島素抵抗模型構(gòu)建方法參照文獻［9］，HepG2細胞用含2×105mo/lL胰島素的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)條件為：37℃，5%CO2培養(yǎng)箱。HepG2細胞分成Control、Model、HPS+Model、PIO+Model一共4組，Control組細胞為正常培養(yǎng)的空白對照細胞，Model組細胞按照HepG2細胞胰島素抵抗模型構(gòu)建方法處理，HPS+Model、PIO+Model組細胞分別在用胰島素誘導液培養(yǎng)細胞的同時，在培養(yǎng)液中同時分別添加10μg/ml紅芪多糖、50μmo/lL吡格列酮。細胞培養(yǎng)24 h后，進行后續(xù)實驗檢測。

1.2.3 葡萄糖檢測試劑盒檢測培養(yǎng)液上清中葡萄糖含量 收集Control、Model、HPS+Model、PIO+Model組細胞培養(yǎng)液上清，按照葡萄糖氧化酶試劑盒標準流程檢測葡萄糖含量，以沒有細胞的孔作為參照，計算細胞葡萄糖消耗量。

1.2.4 肝糖原檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)糖原合成量 收集Control、Model、HPS+Model、PIO+Model組細胞，采用蒽酮法檢測細胞內(nèi)糖原含量，步驟參照試劑盒說明進行。

1.2.5 qRT-PCR檢測PPARγ、PEPCK mRNA表達 收集Control、Model、HPS+Model、PIO+Model組細胞，以GAPDH作為內(nèi)參，用qRT-PCR方法檢測PPARγ、PEPCK mRNA水平。首先用TRIzoi試劑提取各組細胞中的總RNA，配制逆轉(zhuǎn)錄體系反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，體系包括：0.5μl的AMV Reverse Tran‐scriptase、2μl的5×RTbuffer、0.5μl的Oligo-dT、1μl的dNTPs、0.5μl的RNase inhibitor、2μl的RNA，補足DEPC水至10μl，在60℃孵育45 min，95℃孵育5 min，在冰上孵育5 min。取合成的cDNA，進行qP‐CR反應(yīng)，體系包括：0.3μl的Cap Taq酶、0.6μl的Super Green染料、0.4μl的上游引物及0.4μl的下游引物、10μl的2×PCR Buffer for Super Green、2μl的cDNA，最后添加ddH2O至20μl。PCR儀設(shè)置程序為：94℃15 s，58℃15 s，72℃20 s，共40個循環(huán)。PCR引物為：PPARγforward 5′-AAAGAAGCCAA‐CACTAAACC-3′，reverse 5′-CTTCCTTACGGAGAGATCC-3′；PEPCK forward 5′-GCTCTGAGGAGGAGAATGG-3′，reverse 5′-TGCTCTTGGGTGACGATAAC-3′；GAPDH forward 5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′，reverse5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.2.6 Western blot檢測p-AKT、p-PI3K蛋白表達收集Control、Model、HPS+Model、PIO+Model組細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，在細胞中加入5倍體積的蛋白裂解試劑，冰上反應(yīng)20 min。4℃，10 000 g離心15 min，吸取上清并分裝到EP管中。蛋白濃度測定按照BCA常規(guī)方法進行。在每個蛋白樣品中添加1/5體積的5×Loading Buffer溶液，放在100℃ 孵育5 min。SDS-PAGE電泳蛋白量為30μg，電壓為100 V恒壓。肉眼觀察藍色的染料進入到玻璃板的底部邊緣以后，停止電泳。取出凝膠，在冰上轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜電壓設(shè)置為80 V。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將NC膜取出，置于封閉液中，在室溫條件下反應(yīng)1.5 h；然后將NC膜放在含有一抗的抗體孵育袋中，4℃環(huán)境中過夜反應(yīng)；最后把NC膜放在含有二抗的抗體孵育袋中，室溫結(jié)合1.5 h。ECL試劑盒顯色，根據(jù)條帶的灰度值分析蛋白表達水平，內(nèi)參設(shè)置為GAPDH。

1.2.7 PI3K/AKT信號抑制劑對紅芪多糖的影響 HepG2細胞在用胰島素誘導液培養(yǎng)細胞的同時，在培養(yǎng)液中同時添加10μg/ml紅芪多糖和10μmo/lL PI3K/AKT信號抑制劑LY294002，設(shè)置為HPS+LY294002+Model組，以HPS+Model組為參照，分別檢測細胞葡萄糖消耗量（步驟同1.2.3）、糖原合成量（步驟同1.2.4）以及細胞中PPARγ、PEPCK mRNA表達（步驟同1.2.5）和p-AKT、p-PI3K蛋白表達（步驟同1.2.6）。

1.3 統(tǒng)計學分析 SPSS21.0軟件分析數(shù)據(jù)，用±s表示，兩組間數(shù)據(jù)比較用t檢驗，多組差異比較用單因素方差，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的紅芪多糖對HepG2細胞活性影響 20、40、80μg/ml的紅芪多糖處理后的HepG2細胞存活率明顯低于0μg/ml的紅芪多糖處理組。10μg/ml紅芪多糖處理后的HepG2細胞存活率與0μg/ml的紅芪多糖處理組沒有明顯差異。見表1。選用對細胞活性沒有影響的10μg/ml紅芪多糖做后續(xù)實驗。

2.2 紅芪多糖對HepG2細胞胰島素抵抗模型葡萄糖消耗量和糖原合成量的影響 與Control組比較，Model組細胞葡萄糖消耗量水平下降，糖原合成量減少。與Model組比較，HPS+Model、PIO+Model組細胞葡萄糖消耗量水平升高，糖原合成量增加。見表2。紅芪多糖能夠增加HepG2細胞葡萄糖消耗量，改善糖代謝。

2.3 紅芪多糖對HepG2細胞胰島素抵抗模型細胞中PPARγ、PEPCK mRNA表達的影響 與Control組比較，Model組細胞中PPARγmRNA表達水平降低，PEPCK mRNA表達水平升高。與Model組比較，HPS+Model、PIO+Model組細胞中PPARγmRNA表達水平升高，PEPCK mRNA表達水平降低。見表3。

2.4 紅芪多糖對HepG2細胞胰島素抵抗模型細胞中PI3K/AKT信號通路的影響 與Control組比較，Model組細胞中p-AKT、p-PI3K蛋白表達水平降低。與Model組比較，HPS+Model、PIO+Model組細胞中p-AKT、p-PI3K蛋白表達水平升高。見圖1和表4。紅芪多糖可以激活HepG2細胞胰島素抵抗模型細胞中PI3K/AKT信號通路。

表1 不同濃度紅芪多糖處理后的Hep G2細胞存活率比較（±s）Tab.1 Comparison of Hep G2 cell survival rate after treatment with different concentrations of hedys?aryum polysaccharide（±s）

表1 不同濃度紅芪多糖處理后的Hep G2細胞存活率比較（±s）Tab.1 Comparison of Hep G2 cell survival rate after treatment with different concentrations of hedys?aryum polysaccharide（±s）

Note：Compared with 0μg/ml，1）P＜0.05.

Concentrationsof hedysaryumCell survival polysaccharide（μg/ml）rate（%）0 100.00±8.61 1095.26±6.79 2083.14±7.191）4070.22±5.871）8052.36±6.121）F 69.30 P＜0.001

2.5 PI3K/AKT信號抑制劑對紅芪多糖處理的HepG2細胞胰島素抵抗模型中PI3K/AKT信號通路的影響 與HPS+Model組比較，HPS+LY294002+Model組細胞p-AKT、p-PI3K蛋白表達水平下降。見圖2和表5。PI3K/AKT信號抑制劑降低紅芪多糖處理的HepG2細胞胰島素抵抗模型中PI3K/AKT信號通路激活水平。

2.6 抑制PI3K/AKT信號通路對紅芪多糖影響HepG2細胞模型葡萄糖消耗量、糖原合成量和PPARγ、PEPCK mRNA表達的影響 與HPS+Model組比較，HPS+LY294002+Model組細胞葡萄糖消耗量、糖原合成量均減少，PPARγmRNA水平降低，PEPCKmRNA水平升高。見表6。PI3K/AKT信號抑制劑減少紅芪多糖處理的HepG2細胞胰島素抵抗模型葡萄糖消耗量和糖原合成量，減少細胞中PPARγ mRNA表達，促進細胞中PEPCKmRNA表達。

表2 紅芪多糖處理后的Hep G2細胞胰島素抵抗模型細胞葡萄糖消耗量和糖原合成量比較（±s）Tab.2 Comparison of glucose consumption and glycogen synthesis in Hep G2 cells insulin-resistant model cellstreated with hedysaryum polysaccharide（±s）

表2 紅芪多糖處理后的Hep G2細胞胰島素抵抗模型細胞葡萄糖消耗量和糖原合成量比較（±s）Tab.2 Comparison of glucose consumption and glycogen synthesis in Hep G2 cells insulin-resistant model cellstreated with hedysaryum polysaccharide（±s）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05.

GroupsGlucoseGlycogen consumption（mmo/lL）synthesis（mg/g）Control2.14±0.1314.14±1.20 Model1.23±0.111）9.20±0.841）HPS+Model1.84±0.132）11.33±1.022）PIO+Model1.79±0.102）12.54±1.352）F 92.7831.16 P＜0.001＜0.001

表3 紅芪多糖處理后的Hep G2細胞胰島素抵抗模型細胞中PPARγ、PEPCK mRNA水平比較（±s）Tab.3 Comparison of PPARγand PEPCK mRNA levels in Hep G2 cells insulin resistance model cells treat?ed with hedysaryum polysaccharide（±s）

表3 紅芪多糖處理后的Hep G2細胞胰島素抵抗模型細胞中PPARγ、PEPCK mRNA水平比較（±s）Tab.3 Comparison of PPARγand PEPCK mRNA levels in Hep G2 cells insulin resistance model cells treat?ed with hedysaryum polysaccharide（±s）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05.

GroupsPPARγmRNAPEPCK mRNA Control1.00±0.101.00±0.09 Model0.52±0.051）1.89±0.131）HPS+Model0.76±0.072）1.20±0.132）PIO+Model0.80±0.062）1.17±0.102）F 66.51107.30 P＜0.001＜0.001

圖1 Western blot檢測紅芪多糖處理后的Hep G2細胞胰島素抵抗模型細胞中p-AKT、p-PI3K蛋白表達Fig.1 Western blot detection of p-AKT and p-PI3K pro?tein expression in Hep G2 cellsinsulin-resistant mod?el cellstreated with hedysaryum polysaccharide

表4 紅芪多糖處理后的Hep G2細胞胰島素抵抗模型細胞中p-AKT、p-PI3K蛋白水平比較（±s）Tab.4 Comparison of p-AKT and p-PI3K protein levels in insulin-resistant model cells of Hep G2 cells treated with hedysaryum polysaccharide（±s）

表4 紅芪多糖處理后的Hep G2細胞胰島素抵抗模型細胞中p-AKT、p-PI3K蛋白水平比較（±s）Tab.4 Comparison of p-AKT and p-PI3K protein levels in insulin-resistant model cells of Hep G2 cells treated with hedysaryum polysaccharide（±s）

Note：Compared with Control，1）P＜0.05；compared with Model，2）P＜0.05.

Groupsp-AKTAKTPI3Kp-PI3K Control0.40±0.040.92±0.090.99±0.110.56±0.05 Model0.20±0.021）0.91±0.101）1.02±0.121）0.23±0.031）HPS+Model0.29±0.032）0.93±0.082）1.00±0.092）0.53±0.042）PIO+Model0.31±0.042）0.92±0.112）1.03±0.102）0.52±0.062）F53.870.070.2799.63 P＜0.0010.840.88＜0.001

圖2 Western blot檢測紅芪多糖和PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002處理后的Hep G2細胞胰島素抵抗模型細胞中p-AKT、p-PI3K蛋白表達Fig.2 Western blot detect expressions of p-AKT and p-PI3K protein in Hep G2 cells insulin resistance mod?el cells treated with hedysaryum polysaccharide and PI3K/AKT signaling pathway inhibitor LY294002

表5 紅芪多糖和PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002處理后的Hep G2細胞胰島素抵抗模型細胞中p-AKT、p-PI3K蛋白表達水平比較（±s）Tab.5 Comparison of expression levels of p-AKT and p-PI3K proteins in Hep G2 cells insulin-resistant model cells treated with hedysaryum polysaccharide and PI3K/AKT signaling pathway inhibitor LY294002（±s）

表5 紅芪多糖和PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002處理后的Hep G2細胞胰島素抵抗模型細胞中p-AKT、p-PI3K蛋白表達水平比較（±s）Tab.5 Comparison of expression levels of p-AKT and p-PI3K proteins in Hep G2 cells insulin-resistant model cells treated with hedysaryum polysaccharide and PI3K/AKT signaling pathway inhibitor LY294002（±s）

Note：Compared with HPS+Model，1）P＜0.05.

Groupsp-AKTAKTPI3Kp-PI3K HPS+Model0.27±0.040.90±0.100.97±0.110.55±0.06 HPS+LY294002+Model0.18±0.011）0.89±0.121）1.02±0.101）0.32±0.041）t 6.550.191.019.57 P＜0.0010.850.33＜0.001

表6 紅芪多糖和PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002處理后的Hep G2細胞胰島素抵抗模型細胞葡萄糖消耗量、糖原合成量和細胞中PPARγ、PEPCK mRNA水平比較（±s）Tab.6 Comparison of glucose consumption，glycogen synthesis，and PPARγand PEPCK mRNA levels in insulin-resistant model cells of Hep G2 cells treated with hedysaryum polysaccharide and PI3K/AKT signaling pathway inhibitor LY294002（±s）

表6 紅芪多糖和PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002處理后的Hep G2細胞胰島素抵抗模型細胞葡萄糖消耗量、糖原合成量和細胞中PPARγ、PEPCK mRNA水平比較（±s）Tab.6 Comparison of glucose consumption，glycogen synthesis，and PPARγand PEPCK mRNA levels in insulin-resistant model cells of Hep G2 cells treated with hedysaryum polysaccharide and PI3K/AKT signaling pathway inhibitor LY294002（±s）

Note：Compared with HPS+Model，1）P＜0.05.

GroupsGlucoseconsumptionGlycogenPPARγmRNAPEPCK mRNA（mmo/lL）synthesis（mg/g）HPS+Model1.85±0.1412.03±1.181.00±0.101.00±0.12 HPS+LY294002+Model1.35±0.111）8.67±0.961）0.63±0.071）1.56±0.131）t 8.436.639.099.50 P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

3 討論

2型糖尿病是一種非胰島素依賴型的糖尿病，其以胰島素抵抗為主要特征。肝臟作為糖代謝的主要場所，其在胰島素抵抗中扮演關(guān)鍵角色［10］。HepG2細胞是常用的體外研究肝細胞胰島素抵抗模型的細胞之一，其在高濃度的胰島素作用下糖原合成水平下降，葡萄糖消耗水平降低［9］。紅芪是我國傳統(tǒng)中藥，其是豆科植物多序巖黃芪的干燥根，含有多種活性成分，紅芪具有利水、消腫、補氣、止汗等功效［4］。紅芪多糖是提取自紅芪中的雜多糖，具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗炎等功效，紅芪多糖還有治療糖尿病并發(fā)癥、惡性腫瘤、心肌損傷等疾病的作用［11］。研究顯示紅芪多糖可以明顯改善糖尿病大鼠胰島素敏感性和血糖水平［5］。本次實驗顯示，高濃度的胰島素處理后的HepG2細胞糖原合成量減少，葡萄糖消耗量減少，紅芪多糖處理后的HepG2細胞胰島素抵抗模型糖原合成量和葡萄糖消耗量均升高，提示紅芪多糖能夠改善HepG2細胞胰島素抵抗模型糖代謝和胰島素敏感性，這與上述研究結(jié)果相符合，提示紅芪多糖有改善糖尿病的作用。

研究顯示，PPAR具有抑制炎癥、調(diào)節(jié)脂代謝等多種生物學作用，其屬于核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子成員，PPAR含有多個亞型，PPARγ在胰島素抵抗中作用最為廣泛［12］。PPARγ能夠提高外周組織胰島素敏感性，降低胰島素抵抗因子的活性和胰島素受體底物的磷酸化水平［13］。PEPCK是在肝臟中表達的蛋白酶，其是糖異生過程中的關(guān)鍵限速酶之一［14］。PEPCK是PPARγ的下游因子，PPARγ可以降低PEPCK表達水平［15］。本次實驗表明，HepG2細胞胰島素抵抗模型PPARγmRNA水平降低，PEPCK mRNA水平升高，紅芪多糖可以提高HepG2細胞胰島素抵抗模型PPARγmRNA表達水平，降低PEPCK mRNA表達水平，這與檢測的細胞糖原合成量和葡萄糖消耗量結(jié)果相符，均說明紅芪多糖能夠改善HepG2細胞胰島素抵抗模型糖代謝和胰島素敏感性。

PI3K/AKT信號通路具有多種功能，其在人體內(nèi)多種細胞生長、疾病發(fā)生、免疫調(diào)節(jié)等過程中作用廣泛［16］。PI3K是一個存在于細胞內(nèi)的磷脂酰肌醇酶，也是細胞內(nèi)重要的第二信使［17］。AKT位于PI3K的下游，其可以被活化的PI3K磷酸化，進而調(diào)控諸多生理和病理過程［18］。目前在多種疾病如心肌缺血、腫瘤、神經(jīng)損傷中均發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號異常，干預(yù)PI3K/AKT信號可以調(diào)控疾病進程［19-21］。在糖尿病研究中發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號活化水平降低與胰島素抵抗有關(guān)，高濃度的胰島素可以降低HepG2細胞的胰島素敏感性［22-23］。本次實驗顯示，HepG2細胞胰島素抵抗模型中p-PI3K、p-AKT水平下降，而紅芪多糖可提高細胞中p-PI3K、p-AKT水平，PI3K/AKT信號抑制劑可以逆轉(zhuǎn)紅芪多糖對HepG2細胞胰島素抵抗模型的改善作用，這說明紅芪多糖可以通過激活PI3K/AKT信號參與HepG2細胞胰島素抵抗過程。

綜上所述，紅芪多糖具有改善HepG2細胞胰島素抵抗模型糖代謝和胰島素敏感性的作用，其機制與激活PI3K/AKT信號有關(guān)，這為研究紅芪多糖治療糖尿病的作用機制提供參考，為臨床上紅芪多糖治療糖尿病提供了資料。本研究沒有探討紅芪多糖通過影響PI3K/AKT信號發(fā)揮作用的下游靶向調(diào)控機制，在后續(xù)實驗中將會繼續(xù)此部分研究。