王新偉 楊道坤 梁海軍 高海麗 王燕平

（新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院感染疾病科，衛(wèi)輝453100）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染所致臨床結局與機體免疫狀態(tài)密切相關，急性HBV感染可誘導機體細胞免疫增強及IFN-γ和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平升高，促進病毒清除，而慢性HBV感染則誘導機體免疫耐受，導致病毒持續(xù)感染，但具體機制尚未闡明［1］。CD100是免疫信號素家族成員，在體內(nèi)存在2種形式：可溶型CD100（soluble CD100，sCD100）和膜型CD100（membrane-bound CD100，mCD100），可調控機體免疫系統(tǒng)功能，參與多種病毒感染性疾病發(fā)病過程［2-3］。最新研究發(fā)現(xiàn)，CD100參與HBV感染小鼠模型體內(nèi)免疫系統(tǒng)功能調控，但對乙型肝炎患者CD8+T細胞的調控作用及相關機制尚未闡明［4］。因此，本研究檢測CD100在乙型肝炎患者中的表達，觀察重組CD100對乙型肝炎患者CD8+T細胞功能的影響，為闡明HBV感染的免疫應答和炎癥損傷機制提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 主要試劑 淋巴細胞分離液（北京索萊寶公司）；CD8+T細胞分選試劑盒（德國美天旎公司）；抗CD3/CD28（美國eBioscience公司）；重組人CD100（美國R&D公司）；CD100、IFN-γ和TNF-α ELISA檢測試劑盒（武漢華美公司）；抗CD3-APC、抗CD8-APC Cy7、抗CD100-PE（美國BD公司）；穿孔素、顆粒酶B酶聯(lián)吸附斑點試驗（enzyme linked im‐munospot assay，ELISPOT）檢測試劑盒（美國Abcam公司）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細胞毒性檢測試劑盒（武漢碧云天公司）。

1.1.2 主要儀器 SORVALL高速低溫離心機（美國Kendor公司）；磁力分離架（德國美天旎公司）；M680型全自動酶標儀（美國BioRad公司）；FACS‐Calibur流式細胞儀（美國BD公司）；ELISPOT讀板儀（德國AID公司）。

1.1.3 研究對象 本研究方案已通過新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。選擇2018年12月至2019年7月在我院感染疾病科就診的急性乙型肝炎（acute hepatitis B，AHB）患者13例和慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者30例，入選條件：①年齡＞18歲且＜60歲；②未接受抗病毒或免疫調節(jié)治療；③HBsAg、HBeAg和抗HBc陽性；④患者及家屬知情同意。排除條件：①合并其他嗜肝病毒感染，如丙型肝炎病毒（hepatitis Cvirus，HCV）、丁型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒等；②合并失代償期肝硬化、肝衰竭、原發(fā)性肝癌等終末期肝病；③合并惡性腫瘤；④合并自身免疫性疾病；⑤合并心臟、腦、腎臟等重要臟器功能衰竭；⑥妊娠期婦女。選取同期在我院進行體檢、年齡、性別相匹配的17例健康志愿者作為對照。一般資料見表1。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個核細胞（peripheral blood mono‐nuclear cell，PBMCs）分離和CD8+T細胞分選 清晨、空腹采集外周血20 ml，1 000/rmin離心10 min分離血漿，采用淋巴細胞分離液、密度梯度離心法分離PBMCs。采用CD8+T細胞分選試劑盒對20例CHB患者的CD8+T細胞進行分選，取1×107個PBMCs，1 000/rmin離心10 min，棄上清，40μl緩沖液重懸細胞，加入10μl生物素標記的抗體（包含抗CD4、抗CD15、抗CD16、抗CD19、抗CD34、抗CD36、抗CD56、抗CD123、抗TCRγ/δ、抗CD235a），混勻后4℃孵育5 min，加入30μl緩沖液，再加入20μl CD8+T細胞微球抗體（包含抗CD14、抗CD61、抗生物素），混勻后4℃孵育10 min。將分離柱置于磁力分離架上，3 ml緩沖液浸潤，加入上述細胞懸液，收集通過分離柱的未標記細胞，即為富集的CD8+T細胞。

1.2.2 直接接觸培養(yǎng)和間接接觸培養(yǎng)系統(tǒng)構建 采用重組人CD100（終濃度2μg/ml）刺激CD8+T細胞24 h，按照PHILIPS等［5］的方法建立11例HLA-A2限制性CHB患者的CD8+T細胞和HepG2.2.15細胞直接接觸和間接接觸培養(yǎng)系統(tǒng)。直接接觸培養(yǎng)系統(tǒng)：1×105個CD8+T細胞與5×105個HepG2.2.15細胞直接混合培養(yǎng)，同時加入抗CD3/CD28（終濃度1μg/ml）刺激培養(yǎng)。間接接觸培養(yǎng)系統(tǒng)：采用Transwell培養(yǎng)平板，將1×105個CD8+T細胞置于上層小室，同時加入 抗CD3/CD28（終 濃 度1μg/ml），將5×105個HepG2.2.15細胞加入下層小室，采用直徑為0.4μm的半透膜分隔兩層小室，僅可溶性細胞因子可通過，培養(yǎng)48 h后收集上清。

1.2.3 ELISA檢測sCD100和相關細胞因子表達取患者血漿或培養(yǎng)上清進行細胞因子檢測。將100μl標準品和待測樣本加入反應孔中，同時設立空白對照和陰性對照，用封板膠封住反應孔，37℃孵育90 min，吸出樣本，250μ/l孔加入洗滌緩沖液，浸泡1 min后吸出，用吸水紙完全吸干，洗滌5次。100μ/l孔加入生物素標記的二抗，封板膠封住反應孔，37℃孵育60 min，洗板5次，100μ/l孔加入ABC工作液，封板膠封住反應孔，37℃孵育30 min，洗板5次，100μ/l孔加入TMB顯色工作液，37°C避光反應，肉眼可見標準品前3～4孔有明顯藍色梯度、后3～4孔差別不明顯時，即可向每孔中加入100μl TMB終止液，顯色反應最長不超過30 min。酶標儀測定450 nm波長處吸光度，繪制標準曲線，計算各細胞因子濃度。

表1 一般臨床資料（±s）Tab.1 Clinical characteristics（±s）

表1 一般臨床資料（±s）Tab.1 Clinical characteristics（±s）

IndexAHBCHBControl Cases（n）133017 Gender（male/female）8/519/1110/7 Age（year）27.7±8.130.6±9.829.4±7.5 HBV DNA（log10 U/ml）5.11±1.676.34±1.09Not available Anti-HBc IgM（+n）1300 ALT（U/L）762［472，1 109］187［89，301］18［9，29］

1.2.4 流式細胞術檢測CD8+T細胞mCD100表達將PBMCs轉入FACS管中，PBS洗滌2次，加入抗CD3-APC、抗CD8-APC Cy7、抗CD100-PE，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌2次，加入2%多聚甲醛/PBS溶液固定，F(xiàn)ACSCalibur流式細胞儀獲取細胞，F(xiàn)low‐Jo10.6.1軟件分析結果。

1.2.5 ELISPOT檢測CD8+T細胞分泌穿孔素和顆粒酶B水平 預包被的PVDF平板100μ/l孔加入PBS，室溫孵育10 min，吸水紙吸凈液體，5×104個/孔加入CD8+T細胞，加入抗CD3/CD28（終濃度1μg/ml），同時設立陰性對照（無刺激源），于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)20 h，吸水紙吸凈液體，100μ/l孔加入含0.1%吐溫20的PBS，4℃孵育10 min，含0.1%吐溫20的PBS洗滌3次。采用10 ml含有1%BSA的PBS稀釋檢測抗體，100μ/l孔加入稀釋后的檢測抗體，室溫孵育90 min，含0.1%吐溫20的PBS洗滌3次。100μ/l孔加入稀釋的鏈霉親和素堿性磷酸酶（1：5 000），室溫孵育60 min，含0.1%吐溫20的PBS洗滌3次，流動水徹底洗滌每孔，吸水紙吸凈殘留液體，100μ/l孔加入BCIP/NBT顯色底物反應5～15 min，ELISPOT讀板儀對顯色細胞數(shù)進行計數(shù)，分析斑點形成數(shù)（spot forming count，SFC），SFC=樣本SFC-陰性對照SFC。

1.2.6 靶細胞死亡比例檢測 取細胞培養(yǎng)上清，加入96孔板，60μ/l孔加入LDH檢測工作液，混勻后室溫避光孵育30 min，490 nm處測定吸光度，690 nm作為參考波長進行雙波長測定。以HepG2.2.15細胞單獨培養(yǎng)上清的LDH值作為低水平對照，以Tri‐ton X100處理的HepG2.2.15細胞培養(yǎng)上清的LDH值作為高水平對照，靶細胞凋亡比例=（LDH高水平對照-LDH樣本）/（LDH高水平對照-LDH低水平對照）×100%。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學分析，符合正態(tài)分布的計量資料采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析、SNK-q檢驗或配對t檢驗；不符合正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)［Q1，Q3］表示，組間比較采用Wilcoxon配對檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HBV感染者血漿sCD100水平 對照組血漿sCD100水平為（5.63±1.16）ng/ml，AHB組血漿sCD100水平為（6.95±0.90）ng/ml，較對照組升高（P=0.002，圖1），CHB組血漿sCD100水平為（4.89±0.95）ng/ml，較對照組降低（P=0.024，圖1）。

2.2 HBV患者外周血CD8+T細胞mCD100表達 采用FSC和SSC對PBMCs中的淋巴細胞圈門，在淋巴細胞中對CD3+CD8+T細胞圈門，檢測CD3+CD8+T細胞中mCD100+細胞比例，對照組、AHB組和CHB組典型mCD100檢測流式散點圖見圖2A。對照組mCD100+細胞占CD8+T細胞比例為（68.31±10.54）%，AHB組mCD100+細胞占CD8+T細胞比例為（59.56±11.26）%，較對照組降低（P=0.037 0，圖2B），CHB組mCD100+細胞占CD8+T細胞比例為（80.80±7.19）%，較對照組升高（P＜0.000 1，圖2B）。

2.3 重組CD100對CHB患者CD8+T細胞分泌細胞因子的影響 無CD100刺激的CHB患者CD8+T細胞分泌IFN-γ的水平為（258.60±63.56）pg/ml，經(jīng)CD100刺激后CHB患者CD8+T細胞分泌IFN-γ的水平為（302.00±62.29）pg/ml，較無刺激組升高（P=0.036 0，圖3）。無CD100刺激的CHB患者CD8+T細胞分泌TNF-α 水平為（941.2±129.4）pg/ml，經(jīng)CD100刺激后CHB患者CD8+T細胞分泌TNF-α的水平為（1 256.00±79.15）pg/ml，較無刺激組顯著升高（P＜0.000 1，圖3）。

2.4 重組CD100對CHB患者CD8+T細胞穿孔素和細胞分泌穿孔素的細胞數(shù)為（74.57［50.65，165.10］）SFC/106個，經(jīng)CD100刺激后CHB患者CD8+T細胞分泌穿孔素的細胞數(shù)為（154.10［90.56，256.60］）SFC/106個，較無刺激組升高（P=0.018 0，圖4）。無CD100刺激的CHB患者CD8+T細胞分泌顆粒酶B的細胞數(shù)為（59.55［48.62，96.73］）SFC/106個，經(jīng)CD100刺激后CHB患者CD8+T細胞分泌顆粒酶B的細胞數(shù)為（120.10［82.61，163.80］）SFC/106個，較無刺激組升高（P=0.007 3，圖4）。

圖1 各組血漿sCD100水平Fig.1 Plasma sCD100 level in each group

圖2 各組CD8+T細胞中mCD100表達Fig.2 mCD100 expression on CD8+T cells in each group

圖3 無CD100刺激和經(jīng)CD100刺激后CHB患者CD8+T細胞分泌IFN-γ和TNF-α的水平Fig.3 IFN-γand TNF-αlevels secretion by CD8+T cells from CHB patients with and without CD100 stimu?lation

圖4 無CD100刺激和經(jīng)CD100刺激后CHB患者CD8+T細胞分泌穿孔素和顆粒酶B水平Fig.4 Perforin and granzyme B levels secretion by CD8+T cells from CHB patients with and without CD100 stimulation

圖5 無CD100刺激和經(jīng)CD100刺激后直接接觸培養(yǎng)和間接接觸培養(yǎng)系統(tǒng)中CHB患者CD8+T細胞誘導靶細胞凋亡比例Fig.5 Percentage of target cell apoptosis by CD8+T cells from CHB patients with and without CD100 stimu?lation in direct contact and indirect contact co-cul?ture system

2.5 重組CD100對CHB患者CD8+T細胞毒性的影響 直接接觸培養(yǎng)系統(tǒng)中，無CD100刺激的CHB患者CD8+T細胞誘導靶細胞死亡的比例為（14.57±2.44）%，經(jīng)CD100刺激后CHB患者CD8+T細胞誘導靶細胞死亡的比例為（25.00±3.72）%，較無刺激組升高（P＜0.000 1，圖5）。間接接觸培養(yǎng)系統(tǒng)中，無CD100刺激的CHB患者CD8+T細胞誘導靶細胞凋亡的比例為（4.65±0.93）%，經(jīng)CD100刺激后CHB患者CD8+T細胞誘導靶細胞死亡的比例為（5.09±0.95）%，（P=0.280 0，圖5）。

3 討論

多種免疫細胞和免疫分子均參與抗病毒免疫應答。CD100作為重要的免疫調控分子，在體內(nèi)存在sCD100和mCD100 2種形式，mCD100在CD8+T細胞中高表達可抑制其生物學活性［6］。在基質金屬蛋白酶等分子作用下，mCD100從免疫細胞表面脫落形成sCD100，sCD100則是CD100發(fā)揮生物學活性的主要形式［7］。同時，mCD100脫落后形成新的CD8lowCD100-T細胞表型是控制病毒感染的重要細胞亞群［6］。既往研究證實，CD100參與HCV感染后的免疫應答，CD100可通過與其受體相互作用增強B細胞、自然殺傷細胞及CD8+T細胞功能，促進病毒清除［3，8-10］。HBV感染可改變多種免疫分子表達模式，但CD100在HBV感染者中的表達變化及其對免疫細胞的調控作用研究較少。YANG等［4］發(fā)現(xiàn)，CHB患者血清sCD100表達水平降低，而T細胞表面mCD100水平升高，但未納入AHB患者。由于機體免疫狀態(tài)差異，成人感染HBV后常誘導機體產(chǎn)生強烈的免疫應答，短期內(nèi)迅速清除病毒，而兒童時期感染HBV后由于機體免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不完全，機體無法完全清除病毒，易導致感染慢性化，因此，AHB和CHB患者免疫應答存在較大差異。本研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染后根據(jù)機體免疫狀態(tài)的不同可導致CD100表達模式變化，急性HBV感染可誘導機體sCD100水平升高，CD8+T細胞表面mCD100水平降低，可能與AHB患者外周血基質金屬蛋白酶-1水平升高，促進mCD100脫落有關［11］；反之，慢性HBV感染則使血漿sCD100水平下降，CD8+T細胞表面mCD100水平升高。提示不同HBV感染狀態(tài)可導致mCD100和sCD100表達模式改變，可能與CD100在免疫細胞膜表面從表達到脫落的時間半衰期在AHB和CHB中不同有關。慢性HBV感染可能通過抑制免疫細胞表面mCD100脫落導致mCD100水平升高，而發(fā)揮生物學活性的sCD100水平降低，無法有效維持和誘導免疫細胞的殺傷活性，導致感染慢性化。

在口腔扁平苔蘚中，CD100可通過誘導趨化因子CXCL9/CXCL10表達誘導CD8+T細胞向病變部位募集和浸潤［12］。在HBV高壓尾靜脈注射小鼠模型中，重組CD100可通過活化樹突狀細胞和肝血竇內(nèi)皮細胞增強T細胞功能［4］。由于CD8+T細胞存在CD100的受體CD72，因此，推測CD100在HBV感染中可能直接調控CD8+T細胞功能［4，9，13］。AHB患者CD8+T細胞功能增強，CHB患者CD8+T細胞功能衰竭［14-15］。結合本研究發(fā)現(xiàn)的AHB患者sCD100水平升高，而CHB患者sCD100水平降低，本研究主要觀察CD100對CHB患者外周血CD8+T細胞功能的調控作用，CD8+T細胞既可通過穿孔素-顆粒酶B途徑、依賴細胞接觸直接殺傷靶細胞，還可通過分泌細胞因子、不依賴細胞直接接觸誘導靶細胞凋亡［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，CD100不但可促進CHB患者CD8+T細胞分泌穿孔素和顆粒酶B，還可提升IFN-γ和TNF-α表達水平，進一步采用直接接觸和間接接觸培養(yǎng)系統(tǒng)證實CD100對CD8+T細胞的直接殺傷和非細胞殺傷活性，發(fā)現(xiàn)CD100刺激后CD8+T細胞通過分泌細胞因子介導的靶細胞凋亡并未明顯增加，而依賴細胞接觸的直接細胞殺傷功能顯著增強。說明CD100介導的CD8+T細胞分泌細胞因子增加并不足以殺傷靶細胞，而CD100主要通過提升CHB患者CD8+T細胞的直接殺傷活性發(fā)揮細胞毒性作用。慢性HBV感染者中sCD100表達減少無法有效維持CD8+T細胞功能，導致CD8+T細胞功能障礙甚至衰竭。但mCD100可表達于多種免疫細胞（T細胞、B細胞、單核細胞、自然殺傷細胞等）表面，外周血中的sCD100可來源于上述多種免疫細胞膜表面mCD100脫落，因此CD100在其他免疫細胞中的調控作用有待進一步研究。

總之，HBV感染可改變mCD100和sCD100表達模式變化，尤其是在慢性HBV感染中，CD8+T細胞表面mCD100脫落受抑制，導致CD8+T細胞mCD100表達升高及外周血中sCD100水平降低，導致CD8+T細胞功能障礙和機體免疫耐受，誘導HBV感染慢性化。