賈惠旭，李海英，端木慧子

（1黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 1500500；2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080）

0 引言

甜菜M14品系是由栽培甜菜(BetavulgarisL.)與野生白花甜菜(BetacorollifloraZoss.)雜交及多次回交所獲得的甜菜單體附加系[1]，附加了野生白花甜菜第9號(hào)染色體；前期實(shí)驗(yàn)表明甜菜M14品系擁有耐鹽和無融合生殖等優(yōu)良性狀，是用于挖掘優(yōu)質(zhì)基因的良好材料[2-3]。

RIN4(RPM1-interacting protein 4)存在于多種單子葉植物和雙子葉植物中，如番茄、煙草、大豆、玉米和萵苣等[4-5]，是植株正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的蛋白質(zhì)。RIN4是病原相關(guān)分子模式(PAMP)激發(fā)的免疫反應(yīng)PTI(PAMP-triggered immunity)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，其在免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制已有明確報(bào)道，rin4基因的擬南芥突變株系可以增強(qiáng)了PAMP誘導(dǎo)的防御信號(hào)，從而激活擬南芥的免疫應(yīng)答[4-11]。最近的研究也表明，RIN4也參與了效應(yīng)因子觸發(fā)的免疫反應(yīng)ETI。RIN4是效應(yīng)因子AvrB，AvrRpm1和AvrRpt2的靶蛋白[5-8]。正常情況下，RIN4與抗病R蛋白結(jié)合，R蛋白保持非活性狀態(tài)。當(dāng)丁香假單胞菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，細(xì)菌中的效應(yīng)因子AvrB，AvrRpm1和AvrRpm2通過磷酸化或降解RIN4，從而釋放抗病R蛋白，以此為信號(hào)啟動(dòng)植物體內(nèi)的防御應(yīng)答，促使植物體內(nèi)一系列防衛(wèi)機(jī)制的產(chǎn)生[12-17]。

RIN4基因除了參與免疫應(yīng)答，還參與了非生物脅迫。研究顯示，擬南芥RIN4與14-3-3蛋白形成復(fù)合物被質(zhì)膜家族成員GCN4降解后，調(diào)節(jié)氣孔開閉，從而響應(yīng)干旱脅迫[18]；胡楊(Populuseuphratica)PeRIN4基因在擬南芥中異源表達(dá)會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞外排H+的能力，并且抑制了細(xì)胞內(nèi)K+外流，這兩方面共同作用，維持了植物體內(nèi)K+/Na+平衡，使轉(zhuǎn)基因擬南芥能夠有更高的耐鹽性[19]。RIN4定位于質(zhì)膜，它可以通過激活質(zhì)膜H+-ATPase，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞平衡和活性氧平衡，從而使植物應(yīng)答鹽脅迫[20]。

目前，仍然沒有對(duì)RIN4響應(yīng)非生物脅迫的系統(tǒng)研究。因此，本研究對(duì)甜菜M14品系BvM14-RIN4基因進(jìn)行克隆、生物信息學(xué)分析、組織特異性及該基因在鹽脅迫下表達(dá)分析，為進(jìn)一步研究BvM14-RIN4基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 植物材料選用甜菜M14品系（專利號(hào)：CN1263695A），種植于植物培養(yǎng)室。

1.1.2 主要試劑和引物 First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒與KOD-Plus-Ver.2試劑盒均購(gòu)于東洋紡（上海）生物科技有限公司。本實(shí)驗(yàn)訂購(gòu)引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司負(fù)責(zé)合成。

表1 PCR擴(kuò)增用到的所有引物

1.2 方法

1.2.1 甜菜M14品系總RNA提取 使用TRIzol試劑提取甜菜M14品系200 mmol/L NaCl處理下根的總RNA。使用NanoDrop儀器檢測(cè)RNA樣品的A260/A280，并通過1%瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估RNA的純度和完整性。

1.2.2 cDNA第一鏈的合成 按照東洋紡（上海）生物科技有限公司試劑盒First Strand cDNA Synthesis Kit的說明書，進(jìn)行200 mmol/L NaCl脅迫下甜菜M14品系根cDNA反轉(zhuǎn)錄。按照30℃，10 min；42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.3BvM14-RIN4基因cDNA全長(zhǎng)的獲得 使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因特異性引物，上游引物為BvM14-RIN4-S，下游引物為BvM14-RIN4-AS。以鹽脅迫下的根RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并使用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)：94℃，2 min；98℃，10 s；58℃，30 s；74℃，30 s，循環(huán)35次；74℃，7 min。

1.2.4BvM14-RIN4基因生物信息學(xué)分析 使用NCBI網(wǎng)站的ORF Finder程序進(jìn)行開放閱讀框分析；采用ProParam軟件(https://web.expasy.org/protparam/)在線網(wǎng)站對(duì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析；蛋白親水/疏水性分析采用http://us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl在線進(jìn)行；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用SOPMA軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)；蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型使用RaptorX數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行預(yù)測(cè)；使用NCBI網(wǎng)站的Blastp對(duì)BvM14-RIN4蛋白進(jìn)行同源序列搜索，使用DNAman軟件進(jìn)行氨基酸多重序列比對(duì)；使用MEGA7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.2.5BvM14-RIN4基因組織特異性分析和應(yīng)答鹽脅迫分析 分別提取200 mmol/L NaCl處理0、3、6、9、12 h甜菜M14品系葉片和根部總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA第一鏈作為模板。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，以18SrRNA作為內(nèi)參基因，分析BvM14-RIN4基因在甜菜不同組織的表達(dá)模式以及在鹽脅迫下不同組織（根、葉）中不同時(shí)間的表達(dá)模式，qRT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參考SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說明書設(shè)置。每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)和3次生物學(xué)重復(fù)，采用2-△△Ct相對(duì)定量法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，采用方差分析進(jìn)行差異顯著性分析，用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 BvM14-RIN4基因的克隆

2.1.1 甜菜鹽脅迫下的根部總RNA的提取 提取樣品的根部總RNA凝膠電泳圖1顯示：28SrRNA條帶的寬度和亮度是18SrRNA條帶的2倍，A260/A280為1.891，濃度為400 ng/μL，RNA完整性很好，無降解，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 甜菜M14品系根部總RNA提取1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.1.2BvM14-RIN4基因cDNA全長(zhǎng)的獲得 以甜菜M14品系鹽脅迫下的根部總RNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA第一鏈為模板，利用特異引物BvM14-RIN4-S和BvM14-RIN4-AS進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示：BvM14-RIN4基因PCR擴(kuò)增條帶大小大約在250 bp左右，條帶大小符合預(yù)期，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收并與pMD18-T載體連接，獲得重組載體命名為pMD18-T-BvM14-RIN4。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選鑒定陽(yáng)性克隆子，送至測(cè)序公司測(cè)序，結(jié)果顯示克隆成功。

圖2 BvM14-RIN4基因cDNA全長(zhǎng)產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 BvM14-RIN4基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1BvM14-RIN4基因的開放閱讀框分析 開放閱讀框分析結(jié)果如圖3所示：cDNA序列全長(zhǎng)為264 bp（包括終止密碼子），編碼87個(gè)氨基酸。圖中紅色方框?yàn)槠鹗济艽a子，黑色方框?yàn)榻K止密碼子。

圖3 BvM14-RIN4基因cDNA全長(zhǎng)的開放閱讀框

2.2.2 BvM14-RIN4蛋白的理化性質(zhì)分析 利用Protparam在線軟件分析BvM14-RIN4蛋白的分子式為C415H652N130O132S3，分子量為9.67 kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為9.64，帶正電氨基酸殘基總數(shù)(Arg+Lys)為13，帶負(fù)電氨基酸殘基總數(shù)(Asp+Glu)為7，不穩(wěn)定系數(shù)為42.9，脂肪系數(shù)為37.01，平均親疏水系數(shù)為-1.340。

利用ProtScale在線網(wǎng)站對(duì)BvM14-RIN4蛋白進(jìn)行親/疏水性分析，結(jié)果如圖4所示：多肽鏈第83位具有最高分值1.411，疏水性最強(qiáng)：第69位具有最低分值-3.589，親水性最強(qiáng)。此外，整個(gè)肽鏈中親水性氨基酸分布較多?？傮w來看，這條多肽鏈表現(xiàn)出較強(qiáng)的親水性，推測(cè)其為可溶性蛋白。

圖4 BvM14-RIN4蛋白序列的親/疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果

2.2.3 BvM14-RIN4蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用SOPMA軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖5所示。BvM14-RIN4蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成包括：4.44%的α-螺旋，5.51%的β-轉(zhuǎn)角，31.11%的延伸鏈和53.33%的無規(guī)卷曲，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)元件主要為延伸鏈和無規(guī)卷曲。

圖5 BvM14-RIN4蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

使用RaptorX數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖6所示，粉色部分為該蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，紅色部分為該蛋白的疏水區(qū)，白色線條為該蛋白的無序區(qū)域。

圖6 BvM14-RIN4蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

2.2.4 BvM14-RIN4蛋白氨基酸多重序列比對(duì)分析 利用NCBI網(wǎng)站的Blastp對(duì)甜菜BvM14-RIN4基因編碼蛋白序列與擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)、煙草(NicotianatabacumL.)、玉米(ZeamaysL.)、萵苣(LactucasativaL.)、藜麥(ChenopodiumquinoaL.)、菠菜(SpinaciaoleraceaL.)等物種的RIN4蛋白的氨基酸序列進(jìn)行檢索，采用DNAman軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，如圖7所示。結(jié)果表明，RIN4擁有2個(gè)硝酸鹽誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)域NOI（PxFGxW和Y/FTxxF）和含有一個(gè)保守的半胱氨酸殘基。BvM14-RIN4蛋白與菠菜(Spinacia oleraceaL.)的氨基酸序列相似度為76.92%。利用軟件MEGA7.0對(duì)BvM14-RIN4蛋白與其他物種之間的親緣關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，如圖8所示，BvM14-RIN4蛋白與菠菜(SpinaciaoleraceaL.)SoRIN4和藜麥(ChenopodiumquinoaL.)CqRIN4蛋白親緣關(guān)系最近。

圖7 BvM14-RIN4與其他植物RIN4蛋白多重序列比對(duì)

圖8 BvM14-RIN4蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 BvM14-RIN4基因組織特異性分析和應(yīng)答鹽脅迫分析

本研究測(cè)定BvM14-RIN4基因在0、200 mmol/L NaCl脅迫甜菜M14品系葉、根中0、3、6、9、12、24、48 h的表達(dá)情況，結(jié)果如圖9，BvM14-RIN4基因在未處理的甜菜M14品系中根的表達(dá)量是葉的2.26倍，說明其具有組織特異性。BvM14-RIN4基因在200 mmol/L NaCl處理甜菜M14品系根6、24 h時(shí)表達(dá)量顯著增加，分別是0 h的1.96倍和6.84倍；該基因在200 mmol/L NaCl處理甜菜M14品系葉中表達(dá)量沒有明顯變化。

圖9 甜菜M14品系葉和根BvM14-RIN4基因的應(yīng)答鹽脅迫的表達(dá)情況

3 討論與結(jié)論

本研究生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，BvM14-RIN4蛋白是由無規(guī)卷曲和延伸連組成的親水性蛋白，與該蛋白在大多數(shù)物種中的性質(zhì)一致[19-20]。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果證實(shí)該蛋白為固有無序蛋白(IDP)，IDP可以作為蛋白質(zhì)復(fù)合物形成的樞紐，在信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起著重要的作用。BvM14-RIN4蛋白具有硝酸鹽誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)域NOI（PxFGxW和Y/FTxxF），NOI最初是從硝酸鹽誘導(dǎo)的基因中鑒定出來的[22]，該NOI結(jié)構(gòu)與鹽脅迫之間的聯(lián)系還沒有建立。另外本研究結(jié)果顯示，BvM14-RIN4蛋白C末端具有半胱氨酸殘基，DongHyuk等[23]研究表明，擬南芥中AtRIN4半胱氨酸殘基通過翻譯后修飾，可以與周圍的質(zhì)膜(PM)相連，并使該蛋白定位于質(zhì)膜；也有研究顯示，胡楊PeRIN4與質(zhì)膜H+-ATPase相互作用，提高轉(zhuǎn)PeRIN4基因擬南芥的H+外排能力，因此BvM14-RIN4蛋白可能定位于質(zhì)膜并與H+-ATPase相互作用從而應(yīng)答鹽脅迫。BvM14-RIN4蛋白與其他12種植物中RIN4蛋白的氨基酸序列高度同源，該結(jié)果表明RIN4蛋白高度保守，且與Tania等[5]有關(guān)RIN4蛋白的研究結(jié)果一致。此外，進(jìn)化分析表明BvM14-RIN4蛋白與菠菜(SpinaciaoleraceaL.)SoRIN4和藜麥和和藜麥(ChenopodiumquinoaL.)CqRIN4蛋白親緣關(guān)系最近。

BvM14-RIN4基因組織特異性分析結(jié)果顯示，BvM14-RIN4基因在未處理的甜菜M14品系中根的表達(dá)量是葉的2.26倍，說明其具有組織表達(dá)特異性；該基因在鹽處理甜菜M14品系根中表達(dá)量顯著增加，且在鹽處理24 h時(shí)，表達(dá)量達(dá)到最大值，是0 h的6.84倍，說明BvM14-RIN4基因響應(yīng)鹽脅迫，但是該基因在鹽處理的甜菜M14品系葉中表達(dá)量沒有明顯的變化，這可能是因?yàn)楦侵苯咏佑|鹽處理的器官，能快速地應(yīng)答鹽脅迫，因此在鹽脅迫下根中該基因的表達(dá)水平變化明顯。

熒光定量PCR結(jié)果顯示，BvM14-RIN4基因參與甜菜M14品系應(yīng)答鹽脅迫過程，但RIN4基因以何種途徑響應(yīng)非生物脅迫尚不明確，還需要進(jìn)一步的基因功能驗(yàn)證。但隨著研究的不斷深入，基于生物信息學(xué)分析所得結(jié)果可為后續(xù)BvM14-RIN4蛋白功能鑒定、結(jié)構(gòu)分析等研究提供一定基礎(chǔ)信息；而BvM14-RIN4蛋白的同源比對(duì)和進(jìn)化分析結(jié)果也為探討植物中RIN4的起源與進(jìn)化予以借鑒。