陳宏州，楊志香，張新建，楊紅福，徐 超，繆 康，陳 源，姚克兵

（1江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇句容 212400；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095；3揚(yáng)州市蘇靈農(nóng)藥化工有限公司，江蘇揚(yáng)州 225231）

0 引言

主要由藤倉鐮孢菌(Fusariumfujikuroi)引起的水稻惡苗病(rice bakanae disease)，在全球水稻種植區(qū)域均發(fā)生危害[1]，不僅可導(dǎo)致達(dá)40%以上的產(chǎn)量損失[2]，還因病菌產(chǎn)生伏馬毒素等有毒代謝產(chǎn)物而帶來食品安全問題[3-4]。

長期以來，由于缺乏有效的抗病品種，惡苗病的防治仍以化學(xué)藥劑種子處理為主[5]。20世紀(jì)70年代以來，多菌靈和甲基硫菌靈等苯并咪唑類殺菌劑在中國惡苗病防治中應(yīng)用廣泛，但因藥劑作用位點(diǎn)單一，病菌極易產(chǎn)生抗藥性而導(dǎo)致藥劑失效[6]。20世紀(jì)80年代，咪鮮胺等麥角甾醇生物合成抑制類殺菌劑開始用于惡苗病防治同時(shí)對(duì)苯并咪唑類殺菌劑抗性病原有效，但長期單一使用后，病原抗性的產(chǎn)生使藥效降低，部分區(qū)域田間病原菌株對(duì)咪鮮胺抗性頻率甚至達(dá)65%以上[7-8]。氰基丙烯酸酯類殺菌劑——氰烯菌酯，由江蘇省農(nóng)藥研究所1998年合成，結(jié)構(gòu)新穎、作用機(jī)制獨(dú)特，具有極高選擇性和鐮孢菌?；?，與多菌靈和咪鮮胺等無交互抗性，2006年完成相關(guān)制劑臨時(shí)登記，對(duì)惡苗病防效優(yōu)良，可作為防治惡苗病的新藥劑[9-10]。因肌球蛋白-5點(diǎn)突變而產(chǎn)生的病原抗性，導(dǎo)致氰烯菌酯使用未超過10年已在中國浙江省等多個(gè)區(qū)域產(chǎn)生田間抗性菌株，并且抗性種群還在迅速擴(kuò)展[11]。目前，中國有159個(gè)藥劑制劑（包括單劑和復(fù)配劑）登記用于防治惡苗病，但制劑有效成分約85%以上集中在：咪鮮胺、咯菌腈、多菌靈和福美雙，制劑有效成分種類較少?？梢姡旧a(chǎn)中，惡苗病減藥增效控害及抗藥性治理形勢(shì)嚴(yán)峻。

為開發(fā)防治稻惡苗病的新藥劑，筆者采用菌絲生長速率法分別檢測(cè)三唑類殺菌劑——丙硫菌唑與咪唑類殺菌劑——抑霉唑的單劑以及7種配比混劑對(duì)藤倉鐮孢菌的室內(nèi)毒力，分析混劑的聯(lián)合作用類型，并通過田間試驗(yàn)評(píng)價(jià)優(yōu)選混劑對(duì)惡苗病的防效及其安全性，以期為惡苗病減藥增效控害及抗藥性治理提供更多的藥劑選擇。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

藤倉鐮孢菌(Fusariumfujikuroi)，由江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供，菌株經(jīng)單孢分離純化以及基于形態(tài)學(xué)和TEF1-α序列特征的病原鑒定后保存?zhèn)溆肹12]。

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基[13]，用于藤倉鐮孢菌培養(yǎng)、保存以及室內(nèi)毒力測(cè)定。

1.3 供試藥劑

95.2%丙硫菌唑(prothioconazole)原藥，山東海利爾化工有限公司；97%抑霉唑(imazalil)原藥，一帆生物科技集團(tuán)有限公司。

5%丙硫菌唑·抑霉唑WS（丙硫菌唑:抑霉唑=1:1，下同），揚(yáng)州市蘇靈農(nóng)藥化工有限公司；4.23%甲霜·種菌唑ME（登記證號(hào)：PD20120231），愛利思達(dá)生物化學(xué)品有限公司；12%氟啶·戊·殺螟WS（登記證號(hào)：PD20181881），河北博嘉農(nóng)業(yè)有限公司。

1.4 室內(nèi)毒力檢測(cè)

1.4.1 藥劑濃度設(shè)計(jì) 分別將95.2%丙硫菌唑原藥和97%抑霉唑原藥用適量丙酮溶解后加10%吐溫-80，再用無菌水定容至一定體積，均配制成1000 μg/mL母液冷藏備用。丙硫菌唑、抑霉唑和丙硫菌唑·抑霉唑（配比分別為4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3和1:4）混劑在含藥PDA中的濃度均設(shè)計(jì)為0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 μg/mL，均為2倍遞減稀釋的5個(gè)不同濃度梯度PDA培養(yǎng)基。除母液外，所有試驗(yàn)藥劑系列濃度藥液均為現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4.2 檢測(cè)方法 采用菌絲生長速率法[14]，將保存的藤倉鐮孢菌轉(zhuǎn)接到PDA平皿中，在26℃下活化72 h，然后在近菌落邊緣用打孔器制取直徑為4 mm的菌餅，并轉(zhuǎn)接到1.4.1中2倍遞減稀釋配制的含藥PDA系列平皿中，并以不含藥PDA培養(yǎng)基為空白對(duì)照，各處理重復(fù)4次。26℃培養(yǎng)96 h，待對(duì)照中菌落長至約平皿直徑的4/5時(shí)，采用十字交叉法量取菌落直徑。

計(jì)算菌落直徑均值，并按照公式(1)計(jì)算菌絲生長平均抑制率。

采用DPSv7.05版數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計(jì)算出藥劑對(duì)藤倉鐮孢菌菌絲生長抑制的回歸方程、EC50及其95%置信限。

根據(jù) Wadley 法[15]，計(jì)算增效系數(shù)(SR)，如式(2)～(3)。根據(jù)增效系數(shù)(SR)評(píng)價(jià)藥劑混用的聯(lián)合作用類型，即SR＜0.5為拮抗作用，0.5≤SR≤1.5為相加作用，SR＞1.5為增效作用。

其中，A、B分別為殺菌劑單劑，a、b為相應(yīng)單劑在混劑中的比例，EC50(Eth)為混劑EC50理論值，EC50(Eob)為混劑EC50實(shí)測(cè)值。

1.5 田間藥效試驗(yàn)

1.5.1 試驗(yàn)點(diǎn)概況 試驗(yàn)于2020年6—11月，在位于江蘇省句容市白兔鎮(zhèn)的江蘇（鎮(zhèn)江）現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（稻麥）科技綜合示范基地水稻田進(jìn)行，試驗(yàn)田土壤為下蜀馬肝土，有機(jī)質(zhì)含量中等。供試水稻品種為‘武運(yùn)粳24’，由江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供，為惡苗病自然發(fā)病帶菌稻種。

1.5.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)6個(gè)處理分別為5%丙硫菌唑·抑霉唑WS 500、1000和2000倍液，4.23%甲霜·種菌唑ME 1000倍液，12%氟啶·戊·殺螟WS 1000倍液和清水空白對(duì)照，其中4.23%甲霜·種菌唑ME和12%氟啶·戊·殺螟WS設(shè)計(jì)劑量均為推薦劑量。每處理300 g稻種，重復(fù)3次。室溫下浸種48 h后，28℃暗催芽48 h至芽長約半粒谷后旱育秧播種。秧田小區(qū)面積2.5 m2，隨機(jī)區(qū)組排列。每小區(qū)約0.1 m2區(qū)域內(nèi)設(shè)置單粒播種區(qū)（200粒/小區(qū)），用于調(diào)查出苗時(shí)間和出苗率。秧齡30天時(shí)，分別將各小區(qū)秧苗以約為20 cm×15 cm的行株距單株移栽至15 m×4 m大田小區(qū)，各處理隨機(jī)排列。水稻生育期內(nèi)，肥水及其他病蟲草害管理照常規(guī)。

1.5.3 調(diào)查指標(biāo)與方法 發(fā)芽率調(diào)查：浸種48 h后，各處理隨機(jī)取100粒種子，置于9 cm培養(yǎng)皿中28℃暗培養(yǎng)并計(jì)數(shù)發(fā)芽種子數(shù)，計(jì)算發(fā)芽率。成苗率調(diào)查：計(jì)數(shù)單粒播種區(qū)（200粒/小區(qū)）成苗數(shù)，計(jì)算成苗率。

苗素質(zhì)調(diào)查：調(diào)查各處理出苗時(shí)間（約50%出苗時(shí)間），分別于各處理齊苗后7天和15天隨機(jī)取20株秧苗調(diào)查秧苗素質(zhì)，包括調(diào)查株高、莖葉鮮重（地上部分重）、主根長和根重（地下部分重）。

惡苗病防效調(diào)查：苗期，秧齡20天時(shí)，各處理對(duì)角線五點(diǎn)取樣調(diào)查總株數(shù)和病株數(shù)，計(jì)算病株率。分蘗期和抽穗期，每小區(qū)隨機(jī)5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)20穴，調(diào)查總株數(shù)和病株數(shù)，計(jì)算病株率。分別計(jì)算苗期、分蘗期和抽穗期的防治效果[16]，采用DPSv7.05版數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)以Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙硫菌唑與抑霉唑及其混劑對(duì)藤倉鐮孢菌的抑菌效果

室內(nèi)毒力檢測(cè)結(jié)果得出，丙硫菌唑、抑霉唑和丙硫菌唑·抑霉唑（配比分別為4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3和1:4）混劑在處理濃度為0.015625～0.25 μg/mL時(shí)對(duì)藤倉鐮孢菌菌絲生長抑制率分別為27.14%～97.62%、20.48%～69.05%、36.43%～96.67%、37.62%～95.71%、38.57%～95.00%、39.52%～94.76%、33.81%～92.86%、33.10%～92.14%和30.48%～90.95%（表1）。這表明，丙硫菌唑、抑霉唑及其配比為4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3和1:4的混劑對(duì)藤倉鐮孢菌菌絲生長抑制效果明顯，且丙硫菌唑?qū)μ賯}鐮孢菌菌絲生長的抑制活性高于抑霉唑。

表1 丙硫菌唑與抑霉唑及其混劑對(duì)藤倉鐮孢菌菌絲生長的抑制效果

續(xù)表1

2.2 丙硫菌唑與抑霉唑及其混劑對(duì)藤倉鐮孢菌的毒力

室內(nèi)毒力檢測(cè)結(jié)果得出，丙硫菌唑、抑霉唑及其配比為4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3和1:4的混劑對(duì)藤倉鐮孢菌菌絲生長抑制的EC50分別為0.0378、0.0907、0.0301、0.0300、0.0275、0.0270、0.0331、0.0341和0.0385 μg/mL。7種混劑對(duì)藤倉鐮孢菌菌絲生長抑制的增效系數(shù)(SR)分別為 1.4219、1.4767、1.7055、1.9778、1.8671、1.9707和1.8416（表2）。這表明，丙硫菌唑與抑霉唑分別以4:1和3:1的配比復(fù)配對(duì)藤倉鐮孢菌均表現(xiàn)相加作用；丙硫菌唑與抑霉唑分別以2:1、1:1、1:2、1:3和1:4的配比復(fù)配對(duì)藤倉鐮孢菌均表現(xiàn)增效作用，并且1:1配比復(fù)配增效系數(shù)相對(duì)最高。

表2 丙硫菌唑與抑霉唑及其混劑對(duì)藤倉鐮孢菌的毒力測(cè)定結(jié)果

2.3 供試藥劑浸種處理對(duì)水稻種子萌發(fā)和成苗的影響

田間試驗(yàn)結(jié)果得出，5個(gè)藥劑浸種處理對(duì)供試‘武運(yùn)粳24’稻種發(fā)芽率與清水浸種發(fā)芽率無顯著差異，出苗時(shí)間均為播種后3天；5個(gè)藥劑浸種處理對(duì)稻種成苗率均高于清水浸種成苗率，并且差異顯著，但藥劑處理間成苗率無顯著差異。齊苗后7天，5%丙硫菌唑·抑霉唑WS 500倍液浸種秧苗株高和莖葉鮮重均顯著低于其他藥劑處理和清水浸種，但其主根長和根重均與其他藥劑處理和清水浸種無顯著差異；5%丙硫菌唑·抑霉唑WS 1000和2000倍液、12%氟啶·戊·殺螟WS 1000倍液和4.23%甲霜·種菌唑ME 1000倍液浸種秧苗株高均顯著低于清水浸種，但莖葉鮮重、主根長和根重均與清水浸種無顯著差異。齊苗后15天，5%丙硫菌唑·抑霉唑WS 500倍液浸種秧苗株高顯著低于其他藥劑處理和清水浸種，但其莖葉鮮重、主根長和根重均與其他藥劑處理和清水浸種無顯著差異；5%丙硫菌唑·抑霉唑WS 1000倍液、12%氟啶·戊·殺螟WS 1000倍液和4.23%甲霜·種菌唑ME 1000倍液浸種秧苗株高均顯著低于清水浸種，但莖葉鮮重、主根長和根重均與清水浸種無顯著差異；5%丙硫菌唑·抑霉唑WS 2000倍液浸種秧苗株高、莖葉鮮重、主根長和根重均與清水浸種無顯著差異（表3）。這表明5%丙硫菌唑·抑霉唑WS 500、1000和2000倍液、12%氟啶·戊·殺螟WS 1000倍液和4.23%甲霜·種菌唑ME 1000倍液浸種處理對(duì)水稻種子發(fā)芽和成苗安全，在秧苗生長初期，藥劑浸種對(duì)秧苗莖葉生長略有延緩作用。

表3 供試藥劑浸種處理對(duì)水稻種子發(fā)芽和出苗的影響

2.4 供試藥劑浸種處理對(duì)稻惡苗病的防治效果

田間試驗(yàn)結(jié)果得出，5個(gè)藥劑浸種處理對(duì)惡苗病的防效高低依次為5%丙硫菌唑·抑霉唑WS 500倍液＞4.23%甲霜·種菌唑ME 1000倍液＞5%丙硫菌唑·抑霉唑WS 1000倍液＞12%氟啶·戊·殺螟WS 1000倍液＞5%丙硫菌唑·抑霉唑WS 2000倍液，苗期防效分別為91.08%、90.44%、81.89%、73.11%和57.98%，分蘗期防效分別為92.85%、83.36%、74.16%、67.45%和60.35%，抽穗期防效分別為89.53%、83.04%、71.64%、67.95%和60.32%（表4）。這表明，丙硫菌唑與抑霉唑配比為1:1混劑——5%丙硫菌唑·抑霉唑WS對(duì)惡苗病防效優(yōu)良，5%丙硫菌唑·抑霉唑WS 500倍液防效顯著高于4.23%甲霜·種菌唑ME 1000倍液，5%丙硫菌唑·抑霉唑WS 1000倍液防效顯著高于12%氟啶·戊·殺螟WS 1000倍液。

表4 供試藥劑浸種處理對(duì)稻惡苗病的田間防效

3 討論

當(dāng)前，在稻惡苗病防治藥劑有效成分種類有限的情況下，加快新藥劑品種的開發(fā)和對(duì)現(xiàn)有藥劑進(jìn)行科學(xué)合理復(fù)配已成為抗藥性治理和病害綜合防治的有效手段，同時(shí)藥劑復(fù)配對(duì)于延長新藥劑使用壽命、緩解抗性產(chǎn)生、提高藥效、擴(kuò)大防治譜、緩解農(nóng)藥用量快速增長等諸多方面具有重要意義[17]。丙硫菌唑是一種新型廣譜三唑硫酮類殺菌劑，毒性低、無致畸、致突變性、內(nèi)吸活性強(qiáng)，持效期長，同三唑類殺菌劑相比，其具有更廣譜的殺菌活性[18]。抑霉唑是內(nèi)吸性廣譜殺菌劑，對(duì)人畜毒性低，因其良好的殺菌和防腐保鮮作用也被廣泛用作果蔬成熟期的殺菌劑和貯藏期的保鮮劑[19]。丙硫菌唑?qū)好绮》佬?yōu)良[20]，而抑霉唑?qū)μ賯}鐮孢菌抑菌活性及田間防效還鮮有報(bào)道。本研究表明，丙硫菌唑與抑霉唑?qū)μ賯}鐮孢菌菌絲生長具較高的抑制活性，兩者分別以4:1和3:1的配比復(fù)配對(duì)藤倉鐮孢菌均表現(xiàn)相加作用，當(dāng)兩者分別以2:1、1:1、1:2、1:3和1:4的配比復(fù)配對(duì)藤倉鐮孢菌均表現(xiàn)增效作用，并且1:1配比復(fù)配增效作用最強(qiáng)。因此，初步認(rèn)定丙硫菌唑與抑霉唑復(fù)配防治惡苗病的最佳配比為1:1，并按此比例制備5%丙硫菌唑·抑霉唑WS以開展田間試驗(yàn)檢驗(yàn)混劑的防效及安全性。

田間試驗(yàn)結(jié)果表明，5%丙硫菌唑·抑霉唑WS對(duì)惡苗病防效優(yōu)良，對(duì)水稻種子萌發(fā)和成苗安全，具較好的應(yīng)用前景。相關(guān)研究表明，不同浸種藥劑和濃度對(duì)不同水稻品種的種子發(fā)芽率、幼苗根長和苗長影響有差異[21]。本研究中，5%丙硫菌唑·抑霉唑WS和供試對(duì)照藥劑12%氟啶·戊·殺螟WS與4.23%甲霜·種菌唑ME一樣，浸種處理后均對(duì)供試稻種‘武運(yùn)粳24’秧苗生長初期莖葉生長略有延緩作用，因此其安全浸種劑量還有待進(jìn)一步研究。為充分比較供試藥劑對(duì)惡苗病防效，本研究以惡苗病自然發(fā)病帶菌的‘武運(yùn)粳24’稻種為供試稻種，采用藥劑浸種再催芽至芽長約半粒谷后旱育秧播種的方式開展田間試驗(yàn)，2種新型水稻種子處理藥劑12%氟啶·戊·殺螟WS和4.23%甲霜·種菌唑ME對(duì)惡苗病的防效與相關(guān)報(bào)道有較大差異[22-23]，這可能是由于供試稻種及試驗(yàn)方式差異導(dǎo)致的。

本研究，僅進(jìn)行了丙硫菌唑與抑霉唑混劑7種配比篩選以及1年1地的田間藥效試驗(yàn)，混劑的配方、高效穩(wěn)定制劑的研制以及復(fù)配制劑安全使用技術(shù)等方面還有待進(jìn)一步研究，同時(shí)在水稻生產(chǎn)中需科學(xué)合理用藥，以期實(shí)現(xiàn)稻惡苗病減藥增效控害及抗藥性有效治理目標(biāo)。

4 結(jié)論

本研究得出，丙硫菌唑與抑霉唑分別以4:1和3:1的配比復(fù)配對(duì)藤倉鐮孢菌均表現(xiàn)相加作用，當(dāng)兩者分別以2:1、1:1、1:2、1:3和1:4的配比復(fù)配對(duì)藤倉鐮孢菌均表現(xiàn)增效作用，并且1:1配比復(fù)配增效作用最強(qiáng)。以丙硫菌唑與抑霉唑?yàn)?:1的優(yōu)選配比制成的制劑——5%丙硫菌唑·抑霉唑WS對(duì)稻惡苗病防效優(yōu)良，在一定劑量下浸種處理防效均優(yōu)于12%氟啶·戊·殺螟WS和4.23%甲霜·種菌唑ME，并且對(duì)水稻生長安全，具有較好的應(yīng)用前景。