王 佳 李寶坤 魯 皓 李金鳳 陳曉濤 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院石河子832000

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種涉及胰島素影響血糖穩(wěn)定的代謝性疾病,2型糖尿病(diabetes mellitus typeⅡ,T2DM)占全部糖尿病的90%以上[1]。慢性牙周炎(chronic peridontitis,CP)是一種高發(fā)的發(fā)生于牙齒周?chē)С纸M織的慢性感染性疾病。大量研究證實(shí),牙周炎和糖尿病之間存在雙向關(guān)系,二者的免疫病理特征均是以慢性炎癥和免疫失衡為主[2]。T輔助細(xì)胞17(T helper cells 17,Th17)能夠特異性分泌IL-17,從而在促炎和介導(dǎo)自身免疫中發(fā)揮重要作用。本研究通過(guò)2×2析因設(shè)計(jì)檢測(cè)T2DM伴CP患者外周血中的Th17及IL-17水平,分析其與牙周狀態(tài)和血糖控制的關(guān)系,初步闡明Th17/IL-17在T2DM伴CP中的作用和意義。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 病例選擇及分組 選擇2018年7月至2019年7月就診于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科的T2DM合并CP患者共60例,均符合1999年WHO關(guān)于T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)及2012年美國(guó)牙周病協(xié)會(huì)制定的關(guān)于牙周炎分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[3-4]。所有受檢者均經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批件編號(hào)2016029),且患者知情同意。采用2×2析因設(shè)計(jì),根據(jù)牙周狀態(tài)和血糖控制情況分為:HbA1c＜7%的T2DM伴輕度CP(Ⅰ組)15例；HbA1c≥7%的T2DM伴輕度CP(Ⅱ組)15例；HbA1c＜7%的T2DM伴中重度CP(Ⅲ組)15例；HbA1c≥7%的T2DM伴中重度CP(Ⅳ組)15例。

1.1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) ①1999年WHO關(guān)于T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn),即空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L或口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test,OGTT)兩小時(shí)血糖≥11.1 mmol/L[3]；②根據(jù)2012年美國(guó)牙周病協(xié)會(huì)關(guān)于CP的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn),即輕度牙周炎:≥2個(gè)鄰面位點(diǎn)CAL≥3 mm和≥2個(gè)鄰面位點(diǎn)PD≥4 mm(不在同一顆牙上)或1個(gè)鄰面位點(diǎn)(PD≥5 mm)；中度牙周炎:≥2個(gè)鄰面位點(diǎn)CAL≥4 mm(不在同顆牙上),或≥2個(gè)鄰面位點(diǎn)PD≥5 mm(不在同顆牙上)；重度牙周炎:≥2個(gè)鄰面位點(diǎn)CAL≥6 mm(不在同顆牙上)和≥1個(gè)鄰面位點(diǎn)PD≥5 mm。因重度牙周炎病例數(shù)較少,本研究將中度與重度牙周炎納入一組,合并為中重度CP組[4]。

1.1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) ①口內(nèi)余留牙不少于20個(gè)；②近半年內(nèi)未行牙周治療,3個(gè)月內(nèi)未服用抗生素或非甾體類(lèi)抗炎藥物；③接受正規(guī)治療,采用口服降糖藥物或注射胰島素治療,近期病情無(wú)變化。

1.1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ①合并嚴(yán)重的肝腎功能不全者；②合并感染性疾?。虎蹛盒阅[瘤患者；④自身免疫性疾病患者；⑤合并糖尿病其余并發(fā)癥(腎病、視網(wǎng)膜病、神經(jīng)病等)者。

1.1.5 主要試劑及儀器 抗人CD3、CD4、IL-17A單克隆抗體(美國(guó)Biolegend公司)；佛波酯(PMA)、離子霉素(IO)、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(BFA)(美國(guó)Biogems公司)；淋巴細(xì)胞分離液(天津華科生物有限公司)；人IL-17 ELISA試劑盒(美國(guó)R&D公司)；FACS Canto TMⅡ流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 牙周指標(biāo)檢查 對(duì)所有研究對(duì)象進(jìn)行牙周檢查,每顆牙均做頰、舌側(cè)的遠(yuǎn)中、正中和近中6個(gè)位點(diǎn)記錄,統(tǒng)一使用Williams牙周探針進(jìn)行探診深度(probing depth,PD)、出血指數(shù)(bleeding index,BI)檢查。6個(gè)位點(diǎn)的PD和BI平均值即為每顆牙的結(jié)果,受檢牙的平均值即為患者的平均結(jié)果。同時(shí)拍攝曲面斷層片,輔助診斷。

1.2.2 外周血中Th17、Treg水平的檢測(cè) 分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC):清晨空腹采集受檢者外周靜脈血4 ml,肝素抗凝,離心取血漿,-80℃保存待測(cè)。經(jīng)Ficoll密度梯度離心分離PBMC。Th17檢測(cè):將PBMC轉(zhuǎn)移至24孔板,使用刺激物PMA和IO作用1 h后,加入BFA,置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h刺激細(xì)胞活化,并設(shè)置同型對(duì)照組,然后標(biāo)記CD3、CD4抗體,破膜孵育后標(biāo)記IL-17A抗體,測(cè)定Th17細(xì)胞百分比。

1.2.3 血清中IL-17檢測(cè) 將血清按ELISA說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-17,酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算細(xì)胞因子實(shí)際濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,正態(tài)資料以表示,方差齊時(shí)組間比較采用單因素方差分析(One Way ANOVA),組內(nèi)兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。2×2析因分析牙周狀態(tài)與血糖控制對(duì)Th17和IL-17的交互作用,若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,則隨后進(jìn)行單獨(dú)效應(yīng)分析。所有統(tǒng)計(jì)均采用雙側(cè)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料及臨床參數(shù) 各組間年齡、性別、收縮壓、舒張壓差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),Ⅱ組和Ⅳ組的FPG、HbA1c較Ⅰ組和Ⅲ組明顯更高(P＜0.05),Ⅲ組和Ⅳ組的PD、BI較Ⅰ組和Ⅱ組更高(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 外周血中Th17和IL-17的變化 圖1 A圈出部分表示淋巴細(xì)胞及CD3+CD4+T細(xì)胞亞群,圖1B為每組單個(gè)患者的典型Th17(CD3+CD4+IL-17A+)細(xì)胞流式圖。從圖1B和圖2A中可以看出Ⅳ組的Th17細(xì)胞比例明顯較其他3組更高[(1.36±0.36)% vs(0.86±0.31)%,(0.94±0.30)%,(0.92±0.33)%,P＜0.05]。由圖2B可見(jiàn)Ⅳ組的IL-17濃度較其他3組更高[(65.08±18.79)pg/ml vs(39.45±16.16)pg/ml,(44.14±18.34)pg/ml,(41.66±16.65)pg/ml,P＜0.05)]。

2.3 主效應(yīng)分析 主效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)牙周狀態(tài)和血糖控制對(duì)Th17(F=4.396,P=0.041)和IL-17(F=4.29,P=0.043)存在明顯交互作用(表2)。由圖3可知,牙周狀態(tài)和血糖控制對(duì)Th17和IL-17存在協(xié)同升高作用。

表1 研究人群的臨床和牙周參數(shù)(，n=15)Tab.1 Clinical and periodontal parameters of the study population(，n=15)

表1 研究人群的臨床和牙周參數(shù)(，n=15)Tab.1 Clinical and periodontal parameters of the study population(，n=15)

Note:1)P＜0.05 vs GroupⅠ；2)P＜0.05 vs GroupⅡ；3)P＜0.05 vs GroupⅢ.

Index GroupⅠ GroupⅡ GroupⅢ GroupⅣAge(year) 46.6±10.31 54.13±11.54 51.6±9.62 51.6±9.02 Male(%) 47 60 53 60 Systolic blood pressure(mmHg) 129.40±20.70 133.80±23.68 125.73±20.20 129.13±13.99 Diastolic blood pressure(mmHg) 77.60±11.75 79.87±10.20 80.00±13.20 78.47±9.22 FPG(mmol/L) 7.58±1.79 9.35±2.031)3) 7.62±1.73 9.58±2.081)3)HbA1c(%) 6.29±0.29 8.02±0.491)3) 6.47±0.34 8.03±0.461)3)PD(mm) 4.37±0.67 4.58±0.44 6.37±0.641)2) 6.42±0.521)2)BI 1.66±0.65 1.53±0.60 2.40±0.841)2) 2.22±0.621)2)

圖1 每組中單個(gè)患者的Th17(CD3+CD4+IL-17A+)細(xì)胞典型流式圖Fig.1 Representative flow cytometry results of Th17 cells(CD3+CD4+IL-17A+)from a single patient in each group

圖2 各組Th17及IL-17水平Fig.2 Levels of Th17 cells and IL-17 in each group

表2 PD和HbA1c對(duì)Th17/IL-17的主效應(yīng)Tab.2 Main effect of PD and HbA1c on Th17/IL-17

圖3 牙周狀態(tài)與血糖控制對(duì)Th17和IL-17的交互圖Fig.3 Interactions between periodontal status and glycemic control as observed for Th17 cells and IL-17

表3 PD和HbA1c對(duì)Th17/IL-17的單獨(dú)效應(yīng)Tab.3 Individual effects of PD and HbA1c on the Th17/IL-17

2.4 單獨(dú)效應(yīng)分析 在牙周狀態(tài)較輕或血糖控制較好時(shí),血糖控制或牙周狀態(tài)對(duì)Th17和IL-17的單獨(dú)效應(yīng)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在牙周狀態(tài)較差時(shí),血糖控制對(duì)Th17和IL-17存在單獨(dú)效應(yīng)(分別為F=13.572和13.405,P＜0.05)；在血糖控制較差時(shí),牙周狀態(tài)對(duì)Th17和IL-17存在單獨(dú)效應(yīng)(分別為F=12.478和10.716,P＜0.05)。見(jiàn)表3。

3 討論

大量研究證實(shí),牙周炎和DM之間存在雙向關(guān)系,但其雙向關(guān)系的機(jī)制仍沒(méi)有得到充分闡述,越來(lái)越多的研究集中于探討牙周炎與DM的免疫炎癥反應(yīng)機(jī)制。T2DM的發(fā)病基礎(chǔ)是胰島素抵抗(insulin resistance,IR),既往研究表明,IL-17的分泌失調(diào)會(huì)導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的過(guò)度表達(dá)和慢性炎癥,這種炎癥狀態(tài)可能在胰島素抵抗的進(jìn)展中起重要作用[5-6]。牙菌斑作為牙周病的始動(dòng)因子,除了菌斑生物膜的直接損害以外,微生物引起機(jī)體過(guò)度或失衡的免疫反應(yīng)被認(rèn)為是導(dǎo)致牙周組織廣泛破壞的重要因素[7]。Th17細(xì)胞通過(guò)分泌特異性細(xì)胞因子IL-17在牙周炎中發(fā)揮重要免疫調(diào)節(jié)作用,IL-17受體信號(hào)一方面通過(guò)刺激上皮細(xì)胞產(chǎn)生抗菌肽從而保護(hù)牙周組織,另一方面,過(guò)度的IL-17信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可作用于成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞,引起結(jié)締組織破壞和牙槽骨吸收[8]。Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-17在T2DM和CP中均可發(fā)揮重要作用,但對(duì)于Th17細(xì)胞以及IL-17在T2DM合并CP患者的研究較少[9-10]。本實(shí)驗(yàn)擬研究T2DM合并CP患者外周血Th17細(xì)胞比例及血清IL-17水平變化,及其與牙周狀態(tài)和血糖控制的關(guān)系,探討Th17/IL-17在T2DM與CP雙向關(guān)系中的作用和意義。

根據(jù)2×2析因設(shè)計(jì),將HbA1c≥7%認(rèn)為血糖控制較差,根據(jù)美國(guó)牙周病協(xié)會(huì)將CP分為輕度和中重度CP,將T2DM伴CP患者分為4組。單因素方差分析顯示血糖控制較差并伴中重度CP組的Th17和IL-17水平明顯較其他3組更高(P＜0.05),表明血糖控制較差的T2DM伴中重度CP患者體內(nèi)存在更重的免疫炎癥反應(yīng)。較差的血糖控制情況及較重的牙周炎癥狀態(tài)可能會(huì)過(guò)度刺激Th17細(xì)胞,從而引起IL-17等炎癥因子的激活和釋放。IL-17與受體結(jié)合,可激活上游NF-K B、AP1、C/EBP信號(hào)傳導(dǎo)通路,誘導(dǎo)產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì),引起炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和組織損傷[11]。SANTOS等[12]發(fā)現(xiàn)與血糖控制良好的糖尿病患者相比,血糖控制不佳患者的齦溝液中IL-17濃度更高,說(shuō)明血糖控制不良時(shí),更易促進(jìn)局部促炎細(xì)胞因子聚集,引起牙周組織免疫失調(diào),增加DM患者牙周炎的患病可能性。與本研究結(jié)果類(lèi)似,鄧秋艷等[13]的研究表明IL-17可能是牙周炎發(fā)生重要促炎細(xì)胞因子,DM可能通過(guò)Th17細(xì)胞亞群共同發(fā)揮致病作用。

析因分析結(jié)果顯示,牙周狀態(tài)和血糖控制對(duì)Th17和IL-17水平存在交互作用。進(jìn)一步分析單獨(dú)效應(yīng)顯示,牙周狀態(tài)對(duì)Th17和IL-17的單獨(dú)效應(yīng)隨著血糖控制水平的不同而不同,結(jié)合交互圖可以看出,牙周狀態(tài)和血糖控制對(duì)Th17和IL-17存在協(xié)同升高作用,提示在T2DM伴CP患者中,血糖控制越差、牙周炎的程度越重,Th17細(xì)胞比例和IL-17濃度越高,炎癥反應(yīng)越重。與BELKINA等[14]的研究一致,其研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者的免疫反應(yīng)增強(qiáng)與牙周病的嚴(yán)重程度有關(guān)。中重度CP患者牙周袋內(nèi)過(guò)量的IL-17可能通過(guò)牙周袋潰瘍面進(jìn)入血液循環(huán),IL-17參與中性粒細(xì)胞的活化、成熟,高度活化的中性粒細(xì)胞可能是重要的活性氧來(lái)源,引起氧化應(yīng)激,使NF-κB的抑制物激酶(inhibitory kinase,IKK)激活,干擾正常的胰島素傳導(dǎo)通路,導(dǎo)致胰島素抵抗；同時(shí),IKK可激活NF-κB炎癥信號(hào)通路,產(chǎn)生TNF-α、IL-17等炎癥細(xì)胞因子,導(dǎo)致炎癥反應(yīng)出現(xiàn)形成一個(gè)反饋通路,導(dǎo)致T2DM的慢性炎癥狀態(tài)[15]。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致DM并發(fā)癥的主要因素之一,也是影響中性粒細(xì)胞增加的另一個(gè)因素[16]。高血糖條件下晚期糖基化終產(chǎn)物的積累可刺激循環(huán)中的中性粒細(xì)胞。因此,Th17細(xì)胞比例和血清IL-17濃度在血糖控制較差的T2DM合并中重度CP中明顯升高,可能與氧化應(yīng)激的增加和晚期糖基化終產(chǎn)物的產(chǎn)生有關(guān),而較重牙周炎癥狀態(tài)和較差血糖控制對(duì)Th17和IL-17存在協(xié)同升高作用,這些因素能夠促進(jìn)T2DM患者炎癥的惡化。

綜上所述,血糖控制較差的T2DM伴中重度CP患者的外周血Th17細(xì)胞比例和血清IL-17濃度明顯升高,且牙周狀態(tài)和血糖控制可能對(duì)Th17和IL-17存在協(xié)同升高的作用,由此推測(cè)Th17/IL-17可能在T2DM和CP的雙向關(guān)系中具有重要作用,但其確切的致病機(jī)制仍需進(jìn)一步深入探討。