黃慧敏 楊 勇 魏 英 王靳琎 陳琴華 湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院實驗中心十堰442008

女性乳腺癌發(fā)病率占全球女性惡性腫瘤的30%,死亡率占女性惡性腫瘤的15%,且發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。因此,進一步研究乳腺癌的有效治療方法具有重要的意義。近年來,脂質代謝紊亂作為乳腺癌的危險因素,受到國內外學者的關注。硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoylcoenzyme A desaturase 1,SCD1)是脂肪酸從頭合成的關鍵酶,廣泛參與脂肪代謝,進而影響細胞膜結構及信號傳導等生物學功能,與細胞增殖、凋亡及炎癥反應等關系密切[2-3]。研究顯示SCD1的表達與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預后呈負相關[4-7]。本研究擬通過小干擾RNA(small interfreing RNA,siRNA)干擾技術阻斷乳腺癌MCF-7細胞中SCD1表達,通過MTT增殖實驗、Annexin V-FITC/PI染色、ELISA等實驗,檢測SCD1基因沉默后對MCF-7細胞增殖、凋亡及脂質代謝的影響,以期為深入研究SCD1基因在乳腺癌MCF-7細胞中的作用及靶向治療藥物開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7細胞購自中國科學院細胞庫；TRIzol Reagent購自美國Omega公司；反轉錄試劑盒購自美國Fermentas公司；PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；SCD1抗體購自美國Abcam公司；熒光二抗購自優(yōu)寧維公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自美國Sigma公司；MTT購自南京凱基生物有限公司；膽固醇及三酰甘油試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司；全蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物有限公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；PCR引物由上海吉瑪制藥技術有限公司合成,引物序列見表1；SCD1特異性siRNA干擾序列(SCD1-siRNA)和siRNA陰性對照序列(NC-siRNA)由上海吉瑪制藥技術有限公司合成,siRNA寡核苷酸序列見表2。

1.2 方法

1.2.1 細胞來源及其培養(yǎng) 人乳腺癌MCF-7細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng),當細胞密度達到80%～90%時消化傳代,進行各項實驗。

1.2.2 細胞轉染 實驗分成3組:SCD1-siRNA組、NC-siRNA組、Control組。SCD1-siRNA組轉染75 nmol/L的SCD1-siRNA,NC-siRNA組轉染等濃度的NC-siRNA,Control組加入等體積轉染試劑,每組設5個復孔。轉染前1 d,取對數(shù)生長期MCF-7細胞鋪于6孔板,轉染前觀察細胞生長狀態(tài),密度達60%～80%時,按照Lipofectamine2000轉染試劑說明書及siRNA說明書進行細胞轉染。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-PCR

表2 siRNA寡核苷酸序列Tab.2 Sequences of siRNA

1.2.3 熒光顯微鏡觀察siRNA轉染效率 轉染前1 d,將約1.0×105個MCF-7細胞種于24孔板,當細胞密度達70%時,給予FAM標記的siRNA進行轉染,轉染24 h后PBS洗滌2次,倒置熒光顯微鏡下觀察并攝片。熒光顯微鏡攝片時,激發(fā)光為藍光,激發(fā)波長480 nm,各組細胞攝片條件均一致。

1.2.4 RT-PCR法檢測SCD1 mRNA表達 按照

1.2.2 轉染MCF-7細胞,48 h后收集細胞,TRIzol試劑提取總RNA,逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA,RT-PCR檢測SCD1的mRNA表達水平,以GAPDH為內參進行目的基因表達的相對定量分析,引物序列見表1。反應程序為:95℃預變性10 min；95℃變性15 s；62℃反應40 s,40個循環(huán),以2-ΔΔCt值表示待測基因mRNA的表達水平。實驗重復3次。

1.2.5 Western blot法檢測SCD1蛋白的表達 按照1.2.2轉染MCF-7細胞,48 h后收集細胞,加RIPA裂解液提取細胞內總蛋白,BCA法檢測蛋白濃度,GAPDH為內參。取等量蛋白進行電泳并轉膜后,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別加入1∶1 000稀釋的SCD1抗體和GAPDH抗體,4℃過夜,加入相應1∶10 000稀釋的二抗,室溫孵育1 h。ECL發(fā)光,UVP凝膠成像系統(tǒng)顯影,Image J軟件分析目標蛋白的光密度值。

1.2.6 MTT檢測細胞增殖活性 按照1.2.2轉染MCF-7細胞,48 h后消化細胞并計數(shù),5×103個/孔接種于96孔板,每組設5個復孔。24 h后每孔加入5 mg/ml的MTT工作液20μl,5%CO2、37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去培養(yǎng)基,每孔加DMSO 150μl,低速振蕩10 min,酶標儀490 nm波長下測每孔OD值,實驗重復3次。

1.2.7 Annexin V-FITC/PI染色檢測細胞凋亡 ①按照1.2.2轉染MCF-7細胞,48 h后棄上清,PBS清洗3遍,每孔加入1×Binding Buffer工作液500μl,并加Annexin V-FITC 5μl,3 min后再加入PI 10μl,輕輕混勻,室溫避光孵育10 min,熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況。②轉染MCF-7細胞48 h后用不含EDTA·2Na的0.25%胰酶消化并收集細胞至離心管,用4℃預冷的PBS洗滌2次,每孔收集的細胞數(shù)不少于1×106個,各離心管中加入1×Binding Buffer 250μl重懸細胞,細胞懸液中加入Annexin V-FITC 5μl,輕輕混勻后間隔3 min,再加入PI 10μl,室溫避光孵育10 min,各反應管中加入PBS 300μl,再次混勻后于488 nm的流式細胞儀上進行檢測。

1.2.8 細胞膽固醇及三酰甘油水平檢測 按照1.2.2轉染MCF-7細胞,48 h后收集沉淀,PBS清洗3遍,全蛋白提取試劑提取細胞總蛋白,BCA試劑盒檢測總蛋白濃度。細胞內膽固醇及三酰甘油水平按照試劑盒操作說明書測定,并以總蛋白濃度為標準進行校正,酶標儀550 nm波長下檢測樣本OD值。每組設5個復孔,實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)分析及作圖均采用GraphPad Prism 8軟件。計量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布及方差齊性,以表示,三組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用Dunnett-t檢測,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Lipofectamine2000介導FAM標記的siRNA轉染效率測定 不同濃度(0、25、50、75 nmol/L)FAM標記的siRNA轉染MCF-7細胞,24 h后觀察轉染率。結果見圖1,當siRNA濃度為0 nmol/L時,MCF-7細胞無熒光當siRNA濃度為25 nmol/L時,出現(xiàn)熒光,隨著siRNA濃度的增加,熒光強度逐漸增強,當siRNA濃度為75 nmol/L時,熒光強度最強,80%以上MCF-7細胞發(fā)綠色熒光,表明有較多siRNA被轉染入細胞,故后續(xù)實驗中所用siRNA濃度均為75 nmol/L。

圖1 熒光顯微鏡觀察不同濃度FAM標記的siRNA轉染效果Fig.1 Transfection efficiency of different concentrations of FAM-siRNA observed by fluorescence microscope

2.2 RT-PCR法檢測siRNA沉默SCD1基因的效率如圖2所示,NC-siRNA轉染組中SCD1基因的mRNA表達量為0.971±0.043,與Control組(1.0±0.029)相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；而SCD1-siRNA轉染組中SCD1基因的mRNA表達量為0.357±0.026,與NC-siRNA轉染組(0.971±0.043)相比顯著降低(P＜0.001)。結果提示轉染SCD1-siRNA后MCF-7細胞中SCD1 mRNA表達被有效抑制。

2.3 Western blot法檢測SCD1基因沉默對SCD1蛋白表達的影響 如圖3所示,SCD1-siRNA轉染組SCD1蛋白表達水平顯著低于NC-siRNA轉染組和Control組(P＜0.001),NC-siRNA轉染組和Control組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。表明SCD1-siRNA干擾可有效抑制SCD1蛋白表達。

2.4 MTT法檢測SCD1基因沉默對MCF-7細胞增殖的影響 如圖4所示,Control組MCF-7細胞增殖率為(100.00±2.943)%,NC-siRNA轉染組和SCD1-siRNA轉染組細胞增殖率分別為(98.54±2.365)%和(82.25±2.112)%。NC-siRNA轉染組的細胞增殖率和Control組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),SCD1-siRNA轉染組細胞增殖率顯著低于NC-siRNA轉染組(P＜0.01)。表明SCD1基因表達下調后,MCF-7細胞增殖能力受到明顯抑制。

圖2 SCD1-siRNA轉染對MCF-7細胞SCD1 mRNA表達的影響Fig.2 Effect of SCD1-siRNA transfection on expression ofSCD1 mRNA in MCF-7 cells

圖3 SCD1-siRNA轉染對MCF-7細胞中SCD1蛋白表達的影響Fig.3 Effect of SCD1-siRNA transfection on expression of SCD1 protein in MCF-7 cells

2.5 SCD1基因沉默對MCF-7細胞凋亡的影響如圖5A所示,Annexin V-FITC將早期凋亡細胞染成綠色,PI可將晚期凋亡細胞的細胞核染成紅色。熒光顯微鏡下,Control組及NC-siRNA轉染組凋亡細胞較少,SCD1-siRNA轉染組凋亡細胞數(shù)明顯增多,且早期凋亡細胞多于晚期凋亡細胞。流式細胞凋亡圖中,凋亡細胞為早期凋亡細胞數(shù)(Q3)與晚期凋亡細胞數(shù)(Q2)之和。如圖5B所示,Control組、NCsiRNA轉染組和SCD1-siRNA轉染組細胞凋亡率分別為:(5.76±0.438)%、(7.74±0.467)%和(25.96±1.896)%。NC-siRNA轉染組細胞凋亡率與Control組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),SCD1-siRNA轉染組細胞凋亡率顯著上升,與NC-siRNA轉染組相比具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。提示沉默SCD1基因可促進MCF-7細胞凋亡。

圖4 SCD1基因沉默對MCF-7細胞增殖的影響Fig.4 Effect of SCD1 gene silencing on proliferation of MCF-7 cells

圖5 SCD1基因沉默對MCF-7細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of SCD1 gene silencing on apoptosis of MCF-7 cells

2.6 SCD1基因沉默對MCF-7細胞內膽固醇含量的影響 如圖6所示,Control組、NC-siRNA轉染組、SCD1-siRNA轉染組細胞內膽固醇水平分別為:(51.10±4.178)nmol/mg、(48.10±3.229)nmol/mg、(31.29±4.510)nmol/mg。NC-siRNA轉染組與Control組細胞內膽固醇水平,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；SCD1-siRNA轉染組細胞內膽固醇水平較NC-siRNA轉染組顯著降低(P＜0.01)。表明沉默SCD1基因可抑制MCF-7細胞內膽固醇合成。

圖6 SCD1基因沉默對MCF-7細胞內膽固醇含量的影響Fig.6 Effect of SCD1 gene silencing on cholesterol level in MCF-7 cells

圖7 SCD1基因沉默對MCF-7細胞內三酰甘油含量的影響Fig.7 Effect of SCD1 gene silencing on triglyceride level in MCF-7 cells

2.7 SCD1基因沉默對MCF-7細胞內三酰甘油含量的影響 如圖7所示,Control組、NC-siRNA轉染組、SCD1-siRNA轉染組細胞內三酰甘油水平分別為:(61.21±8.949)nmol/mg、(58.66±9.132)nmol/mg、(42.49±3.707)nmol/mg。NC-siRNA轉染組與Control組細胞內三酰甘油水平差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；SCD1-siRNA轉染組細胞內三酰甘油水平較NC-siRNA轉染組顯著降低(P＜0.05)。表明沉默SCD1基因可抑制MCF-7細胞內三酰甘油合成。

3 討論

RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術是調控基因表達、功能基因組學研究的重要方法,siRNA是RNAi過程中的重要產物,具有高度特異性及級聯(lián)放大效應等特點,可在轉錄水平后誘導基因沉默。近年siRNA高效并特異性阻斷了多種腫瘤細胞中靶基因的表達,抑制了腫瘤細胞增殖和侵襲,誘導了腫瘤細胞凋亡,目前已成為研究腫瘤基因靶向治療的重要工具[8-9]。

乳腺癌是全球女性發(fā)病率最高的腫瘤之一。研究顯示,機體脂質代謝與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關,肥胖既是乳腺癌發(fā)病的高危因素,同時影響其預后[10]。SCD1是催化飽和脂肪酸轉化為單不飽和脂肪酸的限速酶,與脂質代謝紊亂關系密切,在結腸癌、肺癌、腎癌、肝癌等多種癌細胞及腫瘤組織中異常表達。MASON等[11]研究發(fā)現(xiàn),降低結腸癌HCT116細胞中SCD1表達,可阻斷脂肪酸的合成從而誘發(fā)細胞凋亡；HESS等[12]研究發(fā)現(xiàn)抑制肺癌H460細胞中SCD1的表達,可阻斷細胞周期進展,誘導細胞程序性死亡從而抑制H460肺癌細胞增殖；VON ROEMELING等[13]發(fā)現(xiàn)在腎透明細胞癌組織中SCD1基因呈高表達,同時體內、體外實驗均表明SCD1缺陷可誘導細胞凋亡,阻斷細胞生長,并促進內質網(wǎng)應激反應；BANSAL等[14]研究發(fā)現(xiàn),SCD1在HepG2等多種肝癌細胞及肝癌組織中高表達,抑制SCD1可顯著提高HepG2細胞對化療藥物的敏感性并抑制肝癌細胞增殖。以上研究表明SCD1是癌癥治療的潛在靶點。

研究SCD1在乳腺癌中的作用可為乳腺癌治療提供新的思路。本研究通過RNAi技術干擾SCD1在人乳腺癌MCF-7細胞中的表達。RT-PCR及Western blot結果顯示,經(jīng)SCD1-siRNA轉染后,SCD1 mRNA及蛋白表達顯著降低,提示MCF-7細胞中SCD1的表達得到有效抑制。細胞的異常生長與增殖是惡性腫瘤最基本的生物學特征之一,本研究MTT細胞增殖實驗顯示,SCD1-siRNA轉染組的細胞增殖率顯著低于NC-siRNA轉染組,即SCD1基因表達下調后,MCF-7細胞的增殖能力受到顯著抑制。細胞凋亡能力降低是腫瘤細胞和正常細胞的重要區(qū)別,本研究進一步通過流式細胞術觀察了SCD1沉默對MCF-7細胞凋亡的影響,結果顯示SCD1表達抑制后,MCF-7細胞凋亡率顯著較高,本研究從反面驗證了SCD1具有促進乳腺癌發(fā)展的作用。趙靜[15]研究發(fā)現(xiàn)SCD1抑制劑MF-438干預MCF-7細胞48 h,可顯著抑制細胞增殖,并誘導MCF-7細胞凋亡,與本研究結果一致。

細胞增殖失控和能量代謝異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關,溫伯格效應與脂肪酸合成增加是腫瘤細胞2個標志性代謝改變[16-17]。脂類作為人體三大營養(yǎng)物質之一,具有儲存和供應能量、參與信號轉導、構成血漿脂蛋白、維持細胞膜結構等重要的生理功能。和正常細胞相比,腫瘤細胞持續(xù)分裂增殖的能力顯著提高,因此需要合成大量的脂質用于新細胞膜和促癌脂質信號分子的合成,并為腫瘤細胞提供能量支持,因此在腫瘤細胞中脂質從頭合成途徑被高度激活[18-20]。本實驗沉默SCD1基因后,MCF-7細胞內膽固醇和三酰甘油水平顯著低于NCsiRNA轉染組。黃光明等[21]研究發(fā)現(xiàn),抑制SCD1表達可明顯降低肝癌SMMC-7721細胞中膽固醇和三酰甘油水平,曹白鴿等[22]研究發(fā)現(xiàn),SCD1過表達后HepG2細胞內脂滴及三酰甘油合成明顯增加,下調SCD1表達細胞內脂滴及三酰甘油合成明顯減少。以上研究結合本實驗結果表明,SCD1在癌細胞脂質合成過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述,SCD1是MCF-7細胞中脂質代謝的關鍵基因,沉默SCD1可顯著抑制MCF-7細胞內脂質代謝水平及細胞增殖,并誘導MCF-7細胞凋亡。本研究為乳腺癌的靶向治療和新藥研發(fā)提供了新的思路和方法,SCD1抑制劑作為乳腺癌治療的新藥值得進一步研究。