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        人源MDN1蛋白質(zhì)的電鏡結(jié)構(gòu)研究

        2021-05-27 11:31:30許云濤李明月雷鳴
        關(guān)鍵詞:人源核糖體細胞株

        許云濤,李明月,雷鳴

        上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院上海精準醫(yī)學(xué)研究院,上海200125

        核糖體是人體內(nèi)負責(zé)蛋白質(zhì)合成的重要細胞器,影響著機體生長和繁殖等一系列活動。核糖體的組裝和成熟是一個高度復(fù)雜的過程,受到很多組裝因子的精密調(diào)控[1-3],該過程的異常會導(dǎo)致心血管、神經(jīng)、骨骼、造血系統(tǒng)等方面的疾病,如骨髓增生異常綜合征(Shwachman-Diamond syndrome,SDS)、先 天 性 角 化 不 良(dyskeratosis congenita,DC)等[4-6]。在眾多參與調(diào)控核糖體組裝的蛋白質(zhì)因子中,AAA-ATPase(ATPase associated with various activities)[7]家族是受到廣泛關(guān)注的一類蛋白質(zhì),該家族成員在不同階段參與釋放或者回收不同的pre-60S核糖體組裝因子,推動核糖體的成熟過程。AAA-ATPase家族成員具有2個基本的特征:其一是氨基酸序列中含有1個或多個保守的AAA結(jié)構(gòu)域,AAA結(jié)構(gòu)域具有ATP水解酶活性,通過水解ATP獲得能量來發(fā)揮其生理功能[8];其二是大多數(shù)AAA-ATPase能夠形成寡聚體,互相結(jié)合,協(xié)同作用,最常見的是形成doughnut-shaped的六聚體環(huán)狀結(jié)構(gòu),這是其發(fā)揮生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[9-11]。在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中,有3種AAA-ATPase參與pre-60S核糖體成熟過程,分別為Ribosome biogenesis ATPase Rix7(Rix7)、Developmentally-regulated GTPbinding protein 1(Drg1)和Rea1[1]。Rix7是第1個與pre-60S核糖體相互作用的AAA-ATPase,主要與組裝因子NOP seven-associated protein 1(Nsa1)釋 放 有 關(guān)[12-13];Drg1主要在胞質(zhì)中發(fā)揮作用,促進組裝因子回收[14-15];而Rea1促進Pescadillo homolog(NOP7)pre-60S complex和Pre-rRNA-processing protein(Rix1)pre-60S complex中的組裝因子釋放,是pre-60S核糖體在核仁以及核質(zhì)成熟中的關(guān)鍵因子[16]。

        在上述3種AAA-ATPase中,Rea1作為在核內(nèi)調(diào)控pre-60S核糖體組裝因子釋放的重要蛋白質(zhì),其敲低、敲除可致酵母死亡,在其他真核生物中對發(fā)育也有非常大的 影 響[17-21]。實 驗 表 明,Rea1的metal ion-dependent adhesion site(MIDAS)結(jié)構(gòu)域與pre-60S核糖體組裝因子Ribosome biogenesis protein Ytm1-Erb1-Nop7(Ytm1-Erb1-Nop7)的MIDAS-interacting domain(MIDO)結(jié)構(gòu)域相互作用,Rea1將Ytm1從pre-60S核糖體上釋放出來[16,22];此外還發(fā)現(xiàn)Rea1在Rix1 pre-60S核糖體中豐度很高,并且通過其ATPase環(huán)狀結(jié)構(gòu)域與Rix1 pre-60S核糖體相互作用[18,22-23]。最 近發(fā)表的酵母 源(Schizosaccharomyces pombe)的結(jié)構(gòu)信息顯示,該蛋白質(zhì)由6個AAA結(jié)構(gòu)域、連接肽(linker)、天冬氨酸/谷氨酸(D/E)以及MIDAS結(jié) 構(gòu) 域組成[24-25];通過AMPPNP和ATP-ribozinoindole1(ATP-Rbin1)2種不同狀態(tài)的對比發(fā)現(xiàn),MIDAS結(jié)構(gòu)域可能通過插入AAA環(huán)與pre-60S核糖體的組分相互作用,從而介導(dǎo)多種組分從pre-60S核糖體釋放[26]。

        Rea1在人源的同源蛋白質(zhì)為midasin AAA-ATPase 1(MDN1),是體內(nèi)相對分子質(zhì)量最大的蛋白質(zhì)之一,全長包含5 596個氨基酸殘基,相對分子質(zhì)量為632 000。MDN1在pre-60S核糖體成熟中發(fā)揮著非常重要的作用,但是其相關(guān)結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究進展緩慢,這很大程度上限制了我們對pre-60S核糖體在核內(nèi)成熟以及裝配的理解。目前對MDN1結(jié)構(gòu)和功能的了解,較多是基于對酵母Real的研究結(jié)論,因此,解析人源MDN1的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),對于闡明包括人類在內(nèi)的哺乳動物MDN1調(diào)控pre-60S核糖體成熟過程的分子機制有著非常重要的意義。本研究通過哺乳細胞表達和蛋白質(zhì)純化體系,獲得全長人源MDN1蛋白質(zhì)樣品,借助120 kV透射電子顯微鏡和單顆粒(singleparticle)重構(gòu)技術(shù),獲得了MDN1蛋白質(zhì)的負染三維結(jié)構(gòu)模型,為后續(xù)解析高分辨MDN1結(jié)構(gòu)奠定了堅實的基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料

        1.1.1主要試劑和儀器三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、氯化鈉(NaCl)、氯化鎂(MgCl2)、甘油(Glycerol)、二 硫 蘇 糖 醇(DTT)、20×磷 酸 緩 沖 液(PBS)、吐溫-20(Tween-20)均購自上海生工生物工程公司,cocktail購自瑞士Roche公司,限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶均購自美國Thermo Fisher公司,牛血清白蛋 白、dulbecco′s modified eagle medium(DMEM)、ANTI-FLAG? M2 Agarose Affinity Gel均購自Sigma(上海)公司,懸浮細胞培養(yǎng)基購自CELL-WISE公司;高速離心機、超速離心機購自美國Beckman Coulter公司,冷凍離心機購自德國Eppendorf公司,電泳儀與電泳槽購自Bio-Rad(中國)公司,細胞流式分選儀購自美國BD公司,細胞計數(shù)儀、高分辨軌道阱質(zhì)譜儀均購自美國Thermo Fisher公司,激光掃描共聚焦顯微鏡購自德國ZEISS公司,碳膜銅網(wǎng)購自北京中鏡科儀技術(shù)有限公司,透射電子顯微鏡購自美國FEI公司。

        1.1.2載體、菌株和細胞pX330-mCherry載體、pUC57載體、E.coli DH5α菌種、Expi293F細胞均由本實驗室保存。

        1.2 實驗方法

        1.2.1引物合成和DNA序列測定均由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司完成。

        1.2.2質(zhì)粒的構(gòu)建針對MDN1基因的5′端設(shè)計包含sgRNA靶位點(cac cgc aag aag tgc tcc atg acc c)的引物,體外退火后連接入pX330-mCherry載體[27],作為CRISPR/Cas9系統(tǒng)[28]gRNA表達質(zhì)粒。同時構(gòu)建一段含有MDN1基因起始密碼子上游1 kb基因組序列,3×FLAG標簽(tag)(DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGGSG GS)編碼序列,以及下游1 kb基因組序列的供體序列,連接在pUC57載體,作為CRISPR/Cas9系統(tǒng)修復(fù)供體質(zhì)粒。

        1.2.3 FLAG-MDN1細胞株構(gòu)建將CRISPR/Cas9系統(tǒng)的sgRNA表達質(zhì)粒和修復(fù)供體質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染Expi293F細胞,采用DMEM(10% FBS)培養(yǎng),48 h后進行流式分選,將mCherry陽性細胞單克隆分選至96孔板。對存活細胞進行傳代培養(yǎng)。存活細胞培養(yǎng)至一定數(shù)量后,抽提基因組進行聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)驗 證(MDN1-FLAG-for,CTC GGG GTG AGG GCC CTG GGT CGC CAC CAT GGA CTA CAA GGA CCA CGA CGG;MDN1-doner-rev,ACT CAC CTG TCC CGT GGC TCA CG);全細胞裂解液用FLAG抗體進行蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)驗證。陽性細胞擴大培養(yǎng)至懸浮狀態(tài),懸浮細胞在無血清懸浮培養(yǎng)基,37℃、5% CO2、140 rpm條件下培養(yǎng)。在細胞密度約為3×106/mL的條件下收取,后進行蛋白質(zhì)純化。

        1.2.4免疫熒光(immunofluorescence,IF)鑒定提前24 h將細胞培養(yǎng)在玻片上。將培養(yǎng)基吸掉,用4%多聚甲醛室溫固定20 min,PBST(PBS+0.5%聚乙二醇辛基苯基醚,TritonX-100)處理15 min,封閉液(5% BSA+PBS+0.1% TritonX-100)封閉30 min,加FLAG一抗4℃孵育過夜。用PBST洗3次,加熒光二抗,室溫孵育40 min。之后用PBST洗3次,加DAPI室溫染色5 min,封片。之后在共聚焦顯微鏡上觀察。

        1.2.5 MDN1蛋白質(zhì)純化表達目的蛋白質(zhì)的Expi293F細胞用1 000×g離心20 min,棄上清,用裂解緩沖液(50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、400 mmol/L NaCl、1 mmol/L MgCl2、10%Glycerol、1 mmol/L DTT、cocktail)重懸,采用液氮凍存法凍存細胞,液氮研磨法裂解細胞。細胞裂解后經(jīng)39 190×g離心50 min,取上清與ANTI-FLAG?M2 Agarose Affinity Gel在4℃低速旋轉(zhuǎn)混合4 h,Gel用洗滌緩沖液(50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、400 mmol/L NaCl、1 mmol/L MgCl2、10% Glycerol、1mmol/L DTT)洗去雜蛋白質(zhì),再用含200 ng/μL FLAG Peptide的洗脫緩沖液(50 mmol/L pH 7.5 Tris-HCl、120 mmol/L NaCl、1 mmol/L MgCl2、1 mmol/L DTT)洗脫目的蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)樣品用100 kD濃縮管濃縮至200μL,通過10%~30%甘油密度梯度離心法,用SW60轉(zhuǎn)子,184 500×g,4℃,14 h分離純化目的蛋白質(zhì)。結(jié)束后每200μL收集,經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析鑒定目的蛋白質(zhì)。

        1.2.6蛋白質(zhì)組分的質(zhì)譜鑒定由于許多樣品中加有去污劑,需要事先沉淀洗滌處理之后才能上機。樣品的處理方法步驟如下:首先沉淀樣品去除樣品中去污劑如TritonX-100,乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P 40,NP40),十二烷基-beta-D-麥芽糖苷(N-Dodecyl-β-D-maltoside,DDM)等。之后重新溶解樣品,還原烷基化,用胰蛋白酶,37℃酶解過夜。最后對酶解溶液進行脫鹽處理,通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)進行分析;質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)提交到Proteome Discoverer 2.3軟件中,使用UniProt數(shù)據(jù)庫中的人(Homo sapiens)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行檢索。

        1.2.7負染樣品制備、數(shù)據(jù)收集及模型構(gòu)建因甲酸雙氧鈾(uranyl formate,UF)溶液滲透能力較強并且顆粒非常細膩,故選擇其作為樣品的負染色液。負染電鏡實驗步驟如下:對碳膜銅網(wǎng)進行親水化處理后,取3μL蛋白質(zhì)溶液滴于碳膜銅網(wǎng),吸附1 min;用濾紙從碳膜銅網(wǎng)邊緣輕輕吸去多余的溶液,滴加10μL UF負染色液(ρ=0.75%),洗2次,染色1 min;用濾紙吸去多余液體,室溫晾干;晾干后將樣品置于120 kV透射電鏡中觀察,放大倍數(shù)設(shè)置為57 000倍,欠焦值設(shè)置為-1~-2μm;選擇樣品顆粒分散性和均一性較好的區(qū)域進行數(shù)據(jù)收集。隨后利用數(shù)據(jù)處理軟件EMAN2[29]和RELION[30]對所收集的圖像進行處理并產(chǎn)生一個三維模型。

        1.2.8 MDN1蛋 白 質(zhì) 結(jié) 構(gòu) 預(yù) 測I-TASSER(Iterative Threading ASSEmbly Refinement)是由密歇根大學(xué)開發(fā)的在線蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測的工具[31],預(yù)測的原理是不相似的氨基酸序列也可以對應(yīng)著相似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。它能從PDB(Protein Data Bank)數(shù)據(jù)庫里識別結(jié)構(gòu)模板,通過基于迭代模板的片段組裝模擬來構(gòu)建完整的結(jié)構(gòu)模型。接著通過蛋白質(zhì)功能數(shù)據(jù)庫BioLiP對3D模型重新線程化,從而預(yù)測靶標的功能。由于MDN1蛋白質(zhì)較大,只對其6個AAA結(jié)構(gòu)域預(yù)測,獲得相應(yīng)的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測數(shù)據(jù)。

        2 結(jié)果

        2.1 構(gòu)建內(nèi)源表達FLAG-MDN1的細胞株

        人源MDN1全長包含5 596個氨基酸殘基,分子量較大,進行克隆和外源表達的難度非常高,因此我們采用對Expi293F細胞內(nèi)源敲入標簽的方法進行內(nèi)源表達。在MDN1蛋白質(zhì)的N端敲入FLAG標簽,用于親和層析(圖1A)。通過CRISPR/Cas9對Expi293F細胞MDN1基因組N端進行定點剪切,再通過帶有FLAG標簽的修復(fù)供體進行修復(fù),然后利用流式細胞術(shù)分選mCherry陽性的單克隆Expi293F細胞進行培養(yǎng)。獲得的單克隆細胞株抽提基因組DNA進行PCR驗證,部分的細胞株樣品能夠獲得預(yù)期的特異性PCR產(chǎn)物,說明相應(yīng)的細胞株已經(jīng)敲入目的FLAG標簽(圖1B)。進一步,利用FLAG抗體對全細胞裂解液進行Western blotting分析,結(jié)果顯示陽性克隆細胞株能夠檢測到目的條帶(圖1C),表明帶有N端FLAG標簽的MDN1蛋白質(zhì)可以正確表達。另外我們也采用IF技術(shù),檢測FLAG-MDN1的表達和定位(圖1D)。上述3種不同的檢測方法,都證實FLAG純化標簽在MDN1蛋白質(zhì)N端成功敲入,獲得正常表達FLAG-MDN1融合蛋白質(zhì)的Expi293F細胞株。

        2.2 MDN1蛋白質(zhì)的純化

        對標簽敲入成功的陽性細胞株進行擴大懸浮培養(yǎng),收取6 L細胞(約1.8×1010個細胞)用裂解緩沖液重懸后,采用液氮研磨法破碎細胞。細胞裂解后經(jīng)高速離心取上清,利用ANTI-FLAG親和層析方法獲得目的蛋白質(zhì)。純化富集的蛋白質(zhì)樣品采用Western blotting和銀染的方法進行檢測(圖1E、F),證實得到的樣品主要包含目的蛋白質(zhì)FLAG-MDN1。將純化樣品采用體積分數(shù)為10%~30%的甘油通過密度梯度離心法進行分離純化,進一步提高樣品的純度和均一性;密度梯度離心獲得的樣品按200μL/管進行組分收集,通過SDS-PAGE和銀染鑒定不同的收集組分,選取純度和均一性較好的樣品用于后續(xù)的實驗(圖1G,孔道9~11)。

        圖1人源內(nèi)源FLAG-MDN1蛋白質(zhì)純化Fig 1 Purification of the human endogenous FLAG-tagged MDN1 protein

        2.3 MDN1蛋白質(zhì)負染電鏡數(shù)據(jù)收集和三維模型的構(gòu)建

        在獲得高純度且均一性較好的MDN1蛋白質(zhì)樣品后,采用負染色電鏡技術(shù)和單顆粒重構(gòu)技術(shù)分析目的蛋白質(zhì)的三維模型。對碳膜銅網(wǎng)進行親水化后,將樣品吸附到碳膜銅網(wǎng),經(jīng)重金屬甲酸雙氧鈾(UF)染色,通過120 kV透射電鏡觀察,結(jié)果表明樣品在負染條件下蛋白質(zhì)濃度合適,顆粒分散性和均一性較好(圖2A)。大部分顆粒的形狀為長條形,長度約29 nm,和預(yù)期分子量大小基本相符(圖2A)。部分顆粒的形狀偏向圓形,可能是MDN1蛋白質(zhì)6個AAA結(jié)構(gòu)域的投影。我們在57 000放大倍數(shù)條件下共收集負染照片103張,運用EMAN2軟件手動挑選顆粒,共挑出16 103個顆粒,之后使用RELION軟件進行二維分類平 均(2D classification)(圖2B)和 三 維 分 類(3D classification)計算。結(jié)果表明MDN1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征明顯(圖2C),用于三維重構(gòu)的顆粒角度分布均勻(圖2D)。

        2.4 MDN1蛋白質(zhì)初步結(jié)構(gòu)分析

        負染數(shù)據(jù)進一步經(jīng)過三維優(yōu)化處理(3D auto-Refine),最終獲得分辨率約為45?的人源MDN1蛋白質(zhì)負染三維結(jié)構(gòu)模型(圖3A)。整個蛋白質(zhì)大小為140?×170?×340?(圖3B),其整體輪廓和已報道的酵母源的MDN1蛋白質(zhì)較為相似[24]。已有的研究預(yù)測MDN1蛋白質(zhì)含有6個AAA結(jié)構(gòu)域(圖1A)[10],借助I-TASSER軟件對該結(jié)構(gòu)域進行模擬,結(jié)果如圖所示(圖3C);進一步對模擬結(jié)果通過UCSF Chimera[32]自動匹配,大致確定了AAA結(jié)構(gòu)域在MDN1蛋白質(zhì)負染結(jié)構(gòu)模型中的位置(圖3D)。將我們的負染三維模型和已報道的酵母源MDN1的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行比較,發(fā)現(xiàn)二者的AAA結(jié)構(gòu)域在整體結(jié)構(gòu)中的定位是類似的(圖3D)[24]。這進一步表明MDN1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在酵母和人之間是較為保守的。

        3 討論

        由于核糖體在細胞中的重要性,其裝配成熟過程一直是相關(guān)研究領(lǐng)域的一個熱點問題。已有的研究表明,AAA-ATPase在pre-60S核糖體成熟和出核過程中發(fā)揮著重要作用[10]。盡管MDN1功能有一些研究報道,也有研究者在2018年發(fā)表了酵母源MDN1的高分辨率結(jié)構(gòu)[24-25],但是人源MDN1的結(jié)構(gòu)研究進展緩慢,目前尚無任何高分辨率結(jié)構(gòu)的報道,這限制了研究人員對MDN1在哺乳動物pre-60S核糖體成熟過程中發(fā)揮作用的分子機制的理解。雖然氨基酸序列分析表明酵母源與人源MDN1蛋白質(zhì)在某些結(jié)構(gòu)域有一定的保守性,但有研究認為人源MDN1在pre-60S核糖體成熟過程中被招募的機制可能有所不同,與其相互作用的核糖體組裝因子也有所差異,例如在人源細胞中MDN1能夠被SUMO化的proline-,glutamic acid-and leucine-rich protein 1(PELP1)招募至pre-60S核糖體[20]。因此,解析人源MDN1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對于闡明哺乳動物MDN1的具體功能和相關(guān)機制有重要的意義。

        圖2負染電鏡分析MDN1蛋白質(zhì)Fig 2 Negative-staining electron microscopy analysis of MDN1

        圖3 MDN1蛋白質(zhì)三維模型和AAA結(jié)構(gòu)域的定位Fig 3 Three-dimensional reconstruction of MDN1 and localization of AAA domains

        MDN1蛋白質(zhì)分子量非常巨大,外源表達有一定的難度,并且整體結(jié)構(gòu)也不適合采用晶體結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法進行解析,所以我們在Expi293F細胞的MDN1蛋白質(zhì)的N端敲入親和純化標簽FLAG,通過親和層析獲得少量的純化樣品進行電鏡結(jié)構(gòu)解析。通過負染色技術(shù)和單顆粒重構(gòu)技術(shù)(single-particle),獲得了MDN1蛋白質(zhì)低分辨率三維結(jié)構(gòu)。從整體輪廓看,MDN1的結(jié)構(gòu)在人源細胞和酵母內(nèi)是較為保守的。另外,我們也利用結(jié)構(gòu)預(yù)測和分子對接的方法,初步確定人源MDN1的AAA結(jié)構(gòu)域在整體結(jié)構(gòu)中的定位。

        MDN1屬于AAA-ATPase家族成員,該家族蛋白質(zhì)包含至少一個結(jié)構(gòu)上非常保守的AAA結(jié)構(gòu)域,再組裝為功能活躍的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。不同于其他寡聚化的AAA-ATPase復(fù)合物,MDN1蛋白質(zhì)氨基酸序列包含有6個AAA結(jié)構(gòu)域,能夠通過自身的肽鏈折疊,形成相應(yīng)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。事實上,我們的負染結(jié)構(gòu)模型也表明人源MDN1是以單體的形式存在,并且有類似的AAA環(huán)狀結(jié)構(gòu),這和酵母源的MDN1是一致的。為了得到人源MDN1高分辨率的結(jié)構(gòu),下一步我們將著重提高MDN1的純化產(chǎn)量,嘗試冷凍電鏡分析。由于采用Expi293F內(nèi)源表達的方法,獲得的MDN1純化樣品相對較少,6 L細胞得到的目的蛋白量為100~120μg,我們將通過擴大細胞培養(yǎng)量,解決這個蛋白質(zhì)產(chǎn)量限制問題,以期獲得MDN1蛋白質(zhì)的冷凍電鏡高分辨結(jié)構(gòu),闡明MDN1在pre-60S核糖體成熟中發(fā)揮作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

        參·考·文·獻

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