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        高山松miR171a及其靶基因的鑒定與表達(dá)分析

        2021-05-26 16:53:34張雪如王穩(wěn)利邱宗波曾倩倩
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年7期
        關(guān)鍵詞:熒光定量PCR

        張雪如 王穩(wěn)利 邱宗波 曾倩倩

        摘要:以裸子植物高山松為試驗(yàn)材料,利用筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的高山松miRNA數(shù)據(jù),通過生物信息學(xué)方法篩選與高山松生長發(fā)育相關(guān)的miR171a,并通過基于RNA連接酶的cDNA末端快速擴(kuò)增法(RLM-5′RACE)驗(yàn)證得出,GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子(Unigene10015)和肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(Unigene83401)的基因?yàn)楦呱剿蒻iR171a的靶基因。通過PCR技術(shù)克隆得到的高山松miR171a前體序列可形成莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu),但其成熟序列的堿基保守性較差。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,pde-miR171a與裸子植物火炬松的進(jìn)化關(guān)系較近。經(jīng)qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn),pde-miR171a在高山松莖中的相對表達(dá)量最高,其次是在針葉中,而靶基因Unigene10015在莖、針葉中的相對表達(dá)量較低,暗示pde-miR171a可以通過調(diào)控靶基因Unigene10015而參與高山松的生長發(fā)育。

        關(guān)鍵詞:高山松;miR171;靶基因;熒光定量PCR

        中圖分類號(hào): S718.46文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

        文章編號(hào):1002-1302(2021)07-0062-05

        收稿日期:2020-08-05

        基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(編號(hào):31500499);河南省高??萍紕?chuàng)新人才項(xiàng)目(編號(hào):16HASTIT019)。

        作者簡介:張雪如(1996—),女,河南洛陽人,碩士研究生,主要從事植物發(fā)育生物學(xué)方面的研究。E-mail:1365655297@qq.com。

        通信作者:邱宗波,博士,教授,主要從事植物分子生物學(xué)方面的研究。E-mail:qiuzongbo@126.com。

        microRNA(miRNA)是一類由21~24個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性單鏈小RNA,主要是在轉(zhuǎn)錄后水平介導(dǎo)靶mRNA的降解或翻譯抑制來調(diào)控基因表達(dá)[1]。自研究者從秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)中發(fā)現(xiàn)第1個(gè) miRNA以來,miRNA一直是研究的熱點(diǎn)[2]。近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn),miRNAs在高山松(Pinus densata)的生長發(fā)育[3]、杉木種子的萌發(fā)[4]及落葉松體胚的生長發(fā)育和形態(tài)建成等方面起著重要的調(diào)控作用[5]。

        miR171是在植物中最早發(fā)現(xiàn)的miRNAs家族成員之一[6],在擬南芥中有3個(gè)miRNA成員,分別是ath-miR171a、ath-miR171b和ath-miR171c[7]。通過基于RNA連接酶的cDNA末端快速擴(kuò)增(RNA ligase-mediated 5′ rapid amplification of cDNA ends,簡稱RLM-5′RACE)試驗(yàn),研究者發(fā)現(xiàn)水稻中的miR171能介導(dǎo)靶基因OsHAM(GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子)mRNA的剪切降解,從而促進(jìn)水稻營養(yǎng)生長向生殖生長的過渡及根尖分生組織穩(wěn)態(tài)的形成[8]。楊樹miR171通過調(diào)控GRAS轉(zhuǎn)錄因子而參與楊樹的生長發(fā)育和光形態(tài)建成的調(diào)控[9]。張力等研究發(fā)現(xiàn),煙草miR171c通過負(fù)調(diào)控SCL靶基因TC134811、TC127385,使植物出現(xiàn)頂端優(yōu)勢喪失和莖稈增多等表型[10]。盡管目前關(guān)于miR171在多個(gè)植物中功能的研究較多,但目前在裸子植物高山松中,miR171的鑒定及其在高山松生長發(fā)育過程中的功能尚不清楚。

        高山松是一種具有重要生態(tài)意義的裸子植物[11]。本研究根據(jù)高山松小RNA高通量測序結(jié)果獲得的miR171a,進(jìn)行前體序列的克隆與分析。通過在線預(yù)測網(wǎng)站獲得 miR171a的靶基因,并通過RLM-5′RACE進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)還分析了miR171a及其靶基因在高山松不同組織部位的表達(dá)特性,為揭示miR171a在高山松生長發(fā)育中的作用提供一定的理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        2月齡的高山松幼苗于2019年5月置于溫室中培養(yǎng)(晝—夜生長溫度周期為 25 ℃—18 ℃,光—暗周期為16 h—8 h,相對濕度為65%~70%)。

        1.2 高山松miR171前體序列的克隆及其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

        使用植物Concert Plant RNA Reagent (美國Invitrogen公司)從2月齡的高山松幼苗中提取總RNA。從筆者所在實(shí)驗(yàn)室得到的高山松miRNA高通量測序數(shù)據(jù)中獲得高山松miR171a的前體序列:5′-AAAGAAUGUGAUGUUGGCUAGGCUCAAUCGGAUUGUAACGCCCACGGAAUUUGGUCUUGUGAUCUGAUUGAGCCGUGCCAAUAUCACAUUCUAAC-3′,用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增(表1)。采用Clustalx 2.0軟件,以高梁sbi-miR171a、擬南芥ath-miR171a、油菜bna-miR171a、玉米 zma-miR171a、大豆gma-miR171a、火炬松pta-miR171a、毛白楊ppt-miR171a、水稻osa-miR171a、毛果楊ptc-miR171a及卷柏smo-miR171a的成熟序列為模板進(jìn)行序列比對。用MEGA 7.0構(gòu)建miR171a前體序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹,通過RNAfold web server在線軟件預(yù)測miR171a前體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

        1.3 高山松miR171a靶基因的預(yù)測與切割位點(diǎn)的驗(yàn)證

        將高山松miR171a的成熟序列提交到靶基因在線預(yù)測網(wǎng)站psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)上,以高山松的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫作為靶標(biāo),設(shè)置期望值為2.5,其余參數(shù)為默認(rèn)值。將預(yù)測到的靶基因比對到GO(gene ontology)數(shù)據(jù)庫中,確定其功能。依據(jù)靶基因的cDNA序列,用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)用于RLM-5′RACE的引物(表1)。RLM-5′RACE試驗(yàn)參照孔雷等的方法[12],擴(kuò)增出的特異產(chǎn)物后進(jìn)行克隆測序。

        1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

        使用植物Concert Plant RNA Reagent (美國Invitrogen公司)分別提取2月齡高山松幼苗根、莖和針葉的總RNA。用Superscript Ⅱ reverse transcriptase (美國Invitrogen公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。熒光定量試驗(yàn)使用Thunderbird SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(日本Toyobo公司)。以actin作為miR171a和靶基因Unigene10015的內(nèi)參基因。利用Rotor-Gene 3000型實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增儀檢測,每個(gè)樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)?;蛳鄬Ρ磉_(dá)量的測定采用2-ΔΔCT法(C表示循環(huán)數(shù);T表示熒光閾值)[13],將基因在根中的表達(dá)水平設(shè)成1。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 pde-miR171a前體序列的擴(kuò)增及二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測

        從筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期得到的高山松miRNA高通量測序數(shù)據(jù)中篩選得到高山松miR171a的前體序列,進(jìn)行引物設(shè)計(jì),以高山松基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到高山松miR171a的前體序列長度為96 bp(圖1)。用RNAfolder軟件在線分析其二級(jí)結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)高山松pre-miR171a可折疊成典型的莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)(圖 2),預(yù)測得出其二級(jí)結(jié)構(gòu)的最小折疊自由能(minimal folding free energy,簡稱MFE)為-230.74 kJ/mol,最小折疊自由能指數(shù)(minimal folding free energy index,MFEI)為1.28,miR171a的成熟序列(5′-UGAUUGAGCCGUGCCA AUAUC-3′)位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的3′端。

        2.2 高山松miR171a成熟序列和前體序列的分析

        對miRBase數(shù)據(jù)庫中不同植物的miR171a成熟序列與高山松miR171a(pde-miR171a)的成熟序列進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)除了高梁sbi-miR171a、pde-miR171a的成熟序列完全一致外,其他物種的miR171a如擬南芥ath-miR171a、玉米zma-miR171a、火炬松pta-miR171a、水稻osa-miR171a、油菜bna-miR171a、大豆gma-miR171a、毛白楊ppt-miR171a、毛果楊ptc-miR171a及卷柏smo-miR171a與高山松pde-miR171a的成熟序列間有1個(gè)或多個(gè)堿基的差異(圖3),表明高山松 pde-miR171a的成熟序列在不同物種中的保守性不高。用MEGA 7.0對毛白楊、玉米、卷柏、高梁、擬南芥、火炬松、大豆、水稻、油菜和高山松的MIR171a共25個(gè)成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果(圖4)顯示,不同物種的MIR171前體保守性不高,高山松與火炬松的前體序列聚為一類,二者間的進(jìn)化關(guān)系較近。

        2.3 高山松miR171a靶基因的預(yù)測及RLM-5′RACE驗(yàn)證以高山松miR171成熟序列為對象、高山松轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為靶標(biāo),用psRNAtarget進(jìn)行pde-miR171a靶基因預(yù)測。如表2所示,pde-miR171a的靶基因分別為GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子(Unigene10015)、肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(Unigene83401) 及未知蛋白 (Unigene84522), 其中pde-miR171a與高山松GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子Unigene10015)的匹配程度最高。

        為了進(jìn)一步驗(yàn)證高山松miR171a對潛在靶基因是否存在剪切作用,筆者用RLM-5′RACE方法對靶基因Unigene10015、Unigene83401 mRNA的3′ 端剪切產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。測序結(jié)果表明,高山松 pde-miR171a對GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子的剪切位點(diǎn)位于第13個(gè)至第14個(gè)堿基之間,對肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的剪切位點(diǎn)位于經(jīng)典切割位點(diǎn)下游第20個(gè)堿基處(圖5),表明GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子(Unigene10015)和肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白(Unigene83401)的基因確實(shí)是miR171a的靶基因,miR171a可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子和肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白基因的表達(dá)。

        2.4 高山松pde-miR171a及其靶基因Unigene10015在不同組織中的表達(dá)分析

        通過熒光定量PCR檢測pde-miR171a及其靶基因Unigene10015在高山松根、 莖和針葉中的表達(dá)情況。結(jié)果(圖6)顯示,pde-miR171a、Unigene10015在高山松不同組織中的表達(dá)情況存在差異,pde-miR171a在莖中的相對表達(dá)量最高,其次在針葉中,而靶基因Unigene10015在莖、針葉中的相對表達(dá)量最低;靶基因Unigene10015的相對表達(dá)量與pde-miR171a的相對表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。

        3 討論與結(jié)論

        隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展,對裸子植物進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序的研究不斷增多,有助于通過生物信息學(xué)方法對miRNAs的鑒定提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)[14-16]。本研究對鑒定到的 miR171a前體基因Pre-miR171a進(jìn)行克隆, 得到miR71a的前體序列長度為96 bp,可形成穩(wěn)定的莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu),說明miR171a確實(shí)在高山松中存在并表達(dá)。最小折疊自由能指數(shù)(minimal folding free energy index,簡稱MFEI)是將miRNA與其他小分子RNA區(qū)分開來的重要參數(shù),一般植物的MFEI大于0.85[17]。在本研究中, miR71a前體的MFEI為1.28, 顯著高于黑胡椒miR171前體的MFEI(0.80)[6],但與擬南芥[18]、水稻[8]和煙草[10]中miRNA前體的MFEI類似。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究高山松miR171a的功能奠定了基礎(chǔ)。

        植物的成熟miRNA能通過核酸互補(bǔ)指導(dǎo)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)去切割或者抑制靶基因表達(dá)[19]。目前主要采用5′RACE(rapid amplification of cDNA ends)的方法驗(yàn)證miRNA對靶基因mRNA的切割作用[12]。筆者用RLM-5′RACE方法對預(yù)測的2個(gè)靶基因Unigene10015(GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子)、Unigene83401(肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示,高山松miR171a介導(dǎo)靶基因Unigene10015(GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子)的mRNA剪切降解,且剪切位點(diǎn)在第13、第14位堿基之間。通過5′RACE試驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn),擬南芥中GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子Scarecrow-Like是miR171的靶基因,切割位點(diǎn)也在第13、第14位堿基之間[7]。另外,高山松miR171a與靶基因Unigene83401(肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白)的切割位點(diǎn)在典型的miRNA切割位點(diǎn)下游第20個(gè)堿基處,這可能是由于siRNA在miRNA切割位點(diǎn)下游第20個(gè)核苷酸處發(fā)生的第2次切割[20]。以上結(jié)果表明,miR71a能夠通過識(shí)別、結(jié)合,然后切割相應(yīng)的靶基因,從而調(diào)控高山松的生長發(fā)育。

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