張雪如 王穩(wěn)利 邱宗波 曾倩倩

摘要：以裸子植物高山松為試驗材料，利用筆者所在實驗室前期構(gòu)建的高山松miRNA數(shù)據(jù)，通過生物信息學方法篩選與高山松生長發(fā)育相關(guān)的miR171a，并通過基于RNA連接酶的cDNA末端快速擴增法（RLM-5′RACE）驗證得出，GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子（Unigene10015）和肌動蛋白結(jié)合蛋白（Unigene83401）的基因為高山松miR171a的靶基因。通過PCR技術(shù)克隆得到的高山松miR171a前體序列可形成莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，但其成熟序列的堿基保守性較差。系統(tǒng)進化分析顯示，pde-miR171a與裸子植物火炬松的進化關(guān)系較近。經(jīng)qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，pde-miR171a在高山松莖中的相對表達量最高，其次是在針葉中，而靶基因Unigene10015在莖、針葉中的相對表達量較低，暗示pde-miR171a可以通過調(diào)控靶基因Unigene10015而參與高山松的生長發(fā)育。

關(guān)鍵詞：高山松;miR171;靶基因;熒光定量PCR

中圖分類號： S718.46文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）07-0062-05

收稿日期：2020-08-05

基金項目：國家自然科學基金（編號：31500499）;河南省高?？萍紕?chuàng)新人才項目（編號：16HASTIT019）。

作者簡介：張雪如（1996—），女，河南洛陽人，碩士研究生，主要從事植物發(fā)育生物學方面的研究。E-mail：1365655297@qq.com。

通信作者：邱宗波，博士，教授，主要從事植物分子生物學方面的研究。E-mail：qiuzongbo@126.com。

microRNA（miRNA）是一類由21～24個核苷酸組成的內(nèi)源性單鏈小RNA，主要是在轉(zhuǎn)錄后水平介導靶mRNA的降解或翻譯抑制來調(diào)控基因表達[1]。自研究者從秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中發(fā)現(xiàn)第1個 miRNA以來，miRNA一直是研究的熱點[2]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在高山松（Pinus densata）的生長發(fā)育[3]、杉木種子的萌發(fā)[4]及落葉松體胚的生長發(fā)育和形態(tài)建成等方面起著重要的調(diào)控作用[5]。

miR171是在植物中最早發(fā)現(xiàn)的miRNAs家族成員之一[6]，在擬南芥中有3個miRNA成員，分別是ath-miR171a、ath-miR171b和ath-miR171c[7]。通過基于RNA連接酶的cDNA末端快速擴增（RNA ligase-mediated 5′ rapid amplification of cDNA ends，簡稱RLM-5′RACE）試驗，研究者發(fā)現(xiàn)水稻中的miR171能介導靶基因OsHAM（GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子）mRNA的剪切降解，從而促進水稻營養(yǎng)生長向生殖生長的過渡及根尖分生組織穩(wěn)態(tài)的形成[8]。楊樹miR171通過調(diào)控GRAS轉(zhuǎn)錄因子而參與楊樹的生長發(fā)育和光形態(tài)建成的調(diào)控[9]。張力等研究發(fā)現(xiàn)，煙草miR171c通過負調(diào)控SCL靶基因TC134811、TC127385，使植物出現(xiàn)頂端優(yōu)勢喪失和莖稈增多等表型[10]。盡管目前關(guān)于miR171在多個植物中功能的研究較多，但目前在裸子植物高山松中，miR171的鑒定及其在高山松生長發(fā)育過程中的功能尚不清楚。

高山松是一種具有重要生態(tài)意義的裸子植物[11]。本研究根據(jù)高山松小RNA高通量測序結(jié)果獲得的miR171a，進行前體序列的克隆與分析。通過在線預測網(wǎng)站獲得 miR171a的靶基因，并通過RLM-5′RACE進行驗證。同時還分析了miR171a及其靶基因在高山松不同組織部位的表達特性，為揭示miR171a在高山松生長發(fā)育中的作用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2月齡的高山松幼苗于2019年5月置于溫室中培養(yǎng)（晝—夜生長溫度周期為 25 ℃—18 ℃，光—暗周期為16 h—8 h，相對濕度為65%～70%）。

1.2 高山松miR171前體序列的克隆及其二級結(jié)構(gòu)預測

使用植物Concert Plant RNA Reagent （美國Invitrogen公司）從2月齡的高山松幼苗中提取總RNA。從筆者所在實驗室得到的高山松miRNA高通量測序數(shù)據(jù)中獲得高山松miR171a的前體序列：5′-AAAGAAUGUGAUGUUGGCUAGGCUCAAUCGGAUUGUAACGCCCACGGAAUUUGGUCUUGUGAUCUGAUUGAGCCGUGCCAAUAUCACAUUCUAAC-3′，用Primer 5.0軟件設計特異性引物進行PCR 擴增（表1）。采用Clustalx 2.0軟件，以高梁sbi-miR171a、擬南芥ath-miR171a、油菜bna-miR171a、玉米 zma-miR171a、大豆gma-miR171a、火炬松pta-miR171a、毛白楊ppt-miR171a、水稻osa-miR171a、毛果楊ptc-miR171a及卷柏smo-miR171a的成熟序列為模板進行序列比對。用MEGA 7.0構(gòu)建miR171a前體序列的系統(tǒng)進化樹，通過RNAfold web server在線軟件預測miR171a前體序列的二級結(jié)構(gòu)。

1.3 高山松miR171a靶基因的預測與切割位點的驗證

將高山松miR171a的成熟序列提交到靶基因在線預測網(wǎng)站psRNATarget（http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/）上，以高山松的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫作為靶標，設置期望值為2.5，其余參數(shù)為默認值。將預測到的靶基因比對到GO（gene ontology）數(shù)據(jù)庫中，確定其功能。依據(jù)靶基因的cDNA序列，用Primer 5.0軟件設計用于RLM-5′RACE的引物（表1）。RLM-5′RACE試驗參照孔雷等的方法[12]，擴增出的特異產(chǎn)物后進行克隆測序。

1.4 實時熒光定量PCR

使用植物Concert Plant RNA Reagent （美國Invitrogen公司）分別提取2月齡高山松幼苗根、莖和針葉的總RNA。用Superscript Ⅱ reverse transcriptase （美國Invitrogen公司）進行反轉(zhuǎn)錄。熒光定量試驗使用Thunderbird SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（日本Toyobo公司）。以actin作為miR171a和靶基因Unigene10015的內(nèi)參基因。利用Rotor-Gene 3000型實時PCR擴增儀檢測，每個樣品設3次生物學重復。基因相對表達量的測定采用2-ΔΔCT法（C表示循環(huán)數(shù);T表示熒光閾值）[13]，將基因在根中的表達水平設成1。

2 結(jié)果與分析

2.1 pde-miR171a前體序列的擴增及二級結(jié)構(gòu)的預測

從筆者所在實驗室前期得到的高山松miRNA高通量測序數(shù)據(jù)中篩選得到高山松miR171a的前體序列，進行引物設計，以高山松基因組DNA為模板進行PCR擴增，得到高山松miR171a的前體序列長度為96 bp（圖1）。用RNAfolder軟件在線分析其二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)高山松pre-miR171a可折疊成典型的莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)（圖 2），預測得出其二級結(jié)構(gòu)的最小折疊自由能（minimal folding free energy，簡稱MFE）為-230.74 kJ/mol，最小折疊自由能指數(shù)（minimal folding free energy index，MFEI）為1.28，miR171a的成熟序列（5′-UGAUUGAGCCGUGCCA AUAUC-3′）位于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的3′端。

2.2 高山松miR171a成熟序列和前體序列的分析

對miRBase數(shù)據(jù)庫中不同植物的miR171a成熟序列與高山松miR171a（pde-miR171a）的成熟序列進行比對，發(fā)現(xiàn)除了高梁sbi-miR171a、pde-miR171a的成熟序列完全一致外，其他物種的miR171a如擬南芥ath-miR171a、玉米zma-miR171a、火炬松pta-miR171a、水稻osa-miR171a、油菜bna-miR171a、大豆gma-miR171a、毛白楊ppt-miR171a、毛果楊ptc-miR171a及卷柏smo-miR171a與高山松pde-miR171a的成熟序列間有1個或多個堿基的差異（圖3），表明高山松 pde-miR171a的成熟序列在不同物種中的保守性不高。用MEGA 7.0對毛白楊、玉米、卷柏、高梁、擬南芥、火炬松、大豆、水稻、油菜和高山松的MIR171a共25個成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果（圖4）顯示，不同物種的MIR171前體保守性不高，高山松與火炬松的前體序列聚為一類，二者間的進化關(guān)系較近。

2.3 高山松miR171a靶基因的預測及RLM-5′RACE驗證以高山松miR171成熟序列為對象、高山松轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為靶標，用psRNAtarget進行pde-miR171a靶基因預測。如表2所示，pde-miR171a的靶基因分別為GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子（Unigene10015）、肌動蛋白結(jié)合蛋白（Unigene83401） 及未知蛋白 （Unigene84522）， 其中pde-miR171a與高山松GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子Unigene10015）的匹配程度最高。

為了進一步驗證高山松miR171a對潛在靶基因是否存在剪切作用，筆者用RLM-5′RACE方法對靶基因Unigene10015、Unigene83401 mRNA的3′ 端剪切產(chǎn)物進行擴增。測序結(jié)果表明，高山松 pde-miR171a對GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子的剪切位點位于第13個至第14個堿基之間，對肌動蛋白結(jié)合蛋白的剪切位點位于經(jīng)典切割位點下游第20個堿基處（圖5），表明GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子（Unigene10015）和肌動蛋白結(jié)合蛋白（Unigene83401）的基因確實是miR171a的靶基因，miR171a可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子和肌動蛋白結(jié)合蛋白基因的表達。

2.4 高山松pde-miR171a及其靶基因Unigene10015在不同組織中的表達分析

通過熒光定量PCR檢測pde-miR171a及其靶基因Unigene10015在高山松根、 莖和針葉中的表達情況。結(jié)果（圖6）顯示，pde-miR171a、Unigene10015在高山松不同組織中的表達情況存在差異，pde-miR171a在莖中的相對表達量最高，其次在針葉中，而靶基因Unigene10015在莖、針葉中的相對表達量最低;靶基因Unigene10015的相對表達量與pde-miR171a的相對表達量呈負相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，對裸子植物進行高通量轉(zhuǎn)錄組測序的研究不斷增多，有助于通過生物信息學方法對miRNAs的鑒定提供數(shù)據(jù)基礎[14-16]。本研究對鑒定到的 miR171a前體基因Pre-miR171a進行克隆， 得到miR71a的前體序列長度為96 bp，可形成穩(wěn)定的莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，說明miR171a確實在高山松中存在并表達。最小折疊自由能指數(shù)（minimal folding free energy index，簡稱MFEI）是將miRNA與其他小分子RNA區(qū)分開來的重要參數(shù)，一般植物的MFEI大于0.85[17]。在本研究中， miR71a前體的MFEI為1.28， 顯著高于黑胡椒miR171前體的MFEI（0.80）[6]，但與擬南芥[18]、水稻[8]和煙草[10]中miRNA前體的MFEI類似。這些結(jié)果為進一步研究高山松miR171a的功能奠定了基礎。

植物的成熟miRNA能通過核酸互補指導RNA誘導的沉默復合體（RISC）去切割或者抑制靶基因表達[19]。目前主要采用5′RACE（rapid amplification of cDNA ends）的方法驗證miRNA對靶基因mRNA的切割作用[12]。筆者用RLM-5′RACE方法對預測的2個靶基因Unigene10015（GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子）、Unigene83401（肌動蛋白結(jié)合蛋白）進行驗證。結(jié)果顯示，高山松miR171a介導靶基因Unigene10015（GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子）的mRNA剪切降解，且剪切位點在第13、第14位堿基之間。通過5′RACE試驗方法發(fā)現(xiàn)，擬南芥中GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子Scarecrow-Like是miR171的靶基因，切割位點也在第13、第14位堿基之間[7]。另外，高山松miR171a與靶基因Unigene83401（肌動蛋白結(jié)合蛋白）的切割位點在典型的miRNA切割位點下游第20個堿基處，這可能是由于siRNA在miRNA切割位點下游第20個核苷酸處發(fā)生的第2次切割[20]。以上結(jié)果表明，miR71a能夠通過識別、結(jié)合，然后切割相應的靶基因，從而調(diào)控高山松的生長發(fā)育。

參考文獻：

[1]Bartel D P. MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function[J]. Cell，2004，116（2）：281-297.

[2]Zhang B H，Pan X P，Cobb G P，et al. Plant microRNA：a small regulatory molecule with big impact[J]. Developmental Biology，2006，289（1）：3-16.

[3]Wan L C，Zhang H Y，Lu S F，et al. Transcriptome-wide identification and characterization of miRNAs from Pinus densata[J]. BMC Genomics，2012，13：132-142.

[4]Cao D C，Xu H M，Zhao Y Y，et al. Transcriptome and degradome sequencing reveals dormancy mechanisms of Cunninghamia lanceolata seeds[J]. Plant Physiology，2016，172（4）：2347-2362.

[5]Li W F，Zhang S G，Han S Y，et al. The post-transcriptional regulation of LaSCL6，by miR171 during maintenance of embryogenic potential in Larix kaempferi（Lamb.）Carr.[J]. Tree Genetics & Genomes，2014，10（1）：223-229.

[6]Asha S，Nisha J，Soniya E V. In silico characterisation and phylogenetic analysis of two evolutionarily conserved miRNAs （miR166 and miR171） from black pepper （Piper nigrum L.）[J]. Plant Molecular Biology Reporter，2013，31：707-718.

[7]Llave C，Xie Z X，Kasschau K D，et al. Cleavage of scarecrow-like mRNA targets directed by a class of Arabidopsis miRNA[J]. Science，2002，297（5589）：2053-2056.

[8]Fan T，Li X M，Yang W，et al. Rice osa-miR171c mediates phase change from vegetative to reproductive development and shoot apical meristem maintenance by repressing four OsHAM transcription factors[J]. PLoS One，2015，10（5）：e0125833.

[9]劉志祥，曾超珍，曾渭賢，等. 楊樹MIR171基因家族進化與功能分化研究[J]. 植物遺傳資源學報，2014，15（2）：313-319.

[10]張 力，沙愛華. 煙草microRNA171c的功能分析[J]. 植物科學學報，2016，34（5）：775-780.

[11]Wang B S，Mao J F，Gao J，et al. Colonization of the Tibetan plateau by the homoploid hybrid pine Pinus densata[J]. Molecular Ecology，2011，20（18）：3796-3811.

[12]孔 雷，朱向向，王屹瑋，等. 茶樹miR164a及其靶基因的鑒定與表達分析[J]. 茶葉科學，2018，38（6）：547-558.

[13]Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods，2001，25（4）：402-408.

[14]Qiu Z B，Wan L C，Chen T，et al. The regulation of cambial activity in Chinese fir （Cunninghamia lanceolata） involves extensive transcriptome remodelling[J]. New Phytologist，2013，199（3）：708-719.

[15]Wang L，Zhao J，Luo K，et al. Deep sequencing discovery and profiling of conserved and novel miRNAs in the ovule of Ginkgo biloba[J]. Trees，2016，30（5）：1557-1567.

[16]Wen C H，Lin S S，Chu F H. Transcriptome analysis of a subtropical deciduous tree：autumn leaf senescence gene expression profile of Formosan gum[J]. Plant & Cell Physiology，2015，56（1）：163-174.

[17]Zhang B H，Pan X P，Cox S B，et al. Evidence that miRNAs are different from other RNAs[J]. Cellular and Molecular Life Sciences，2006，63（2）：246-254.

[18]Wang L，Mai Y X，Zhang Y C，et al. 2010. MicroRNA171c-targeted SCL6-Ⅱ，SCL6-Ⅲ and SCL6-Ⅳ genes regulate shoot branching in Arabidopsis[J]. Molecular Plant，3（5）：794-806.

[19]Carthew R W，Sontheimer E J. Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs[J]. Cell，2009，136（4）：642-655.

[20]Ronemus M，Vaughn M W，Martienssen R A. MicroRNA-targeted and small interfering RNA-mediated mRNA degradation is regulated by argonaute，dicer，and RNA-dependent RNA polymerase in Arabidopsis[J]. Plant Cell，2006，18（7）：1559-1574.