方偉敏 弓淑樺 何卜卜 田世彪 趙會(huì)君

摘要：以寧杞1號(hào)無菌實(shí)生苗的葉片、下胚軸以及莖尖生長點(diǎn)組織為材料，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)置不同的激素濃度比例，誘導(dǎo)不同外植體產(chǎn)生叢生芽并完成形態(tài)建成。采用水培處理方式，分別設(shè)置0、100、200 mmol/L NaCl脅迫梯度，于處理后1、2、3 d分別測(cè)定地上部超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）的活性，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)APX、Cu/Zn-SOD、GST、Fe-SOD基因的表達(dá)變化模式。結(jié)果表明，MS+1.0 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）+0.2 mg/L萘乙酸（NAA）的培養(yǎng)基能快速誘導(dǎo)頂端組織及葉片組織中叢生芽的生長，而莖段呈現(xiàn)愈傷化和玻璃化情況，叢生芽在MS培養(yǎng)基上能完成生根，形態(tài)建成良好。鹽脅迫下的葉片中保持著較高濃度的POD酶活性，而CAT活性卻被抑制，與抗氧化脅迫相關(guān)的SOD、GST以及APX基因在鹽脅迫下表達(dá)倍數(shù)顯著性增加，而Fe-SOD酶基因卻顯著性被抑制，本研究為寧夏枸杞組培快繁體系的建立，組培苗抗鹽機(jī)制提供了理論支持。

關(guān)鍵詞：寧夏枸杞;組織培養(yǎng);鹽脅迫;抗氧化酶;實(shí)時(shí)熒光定量

中圖分類號(hào)： S567.1+90.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）07-0057-05

收稿日期：2020-08-27

基金項(xiàng)目：北方民族大學(xué)國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（編號(hào)：201811407015）;寧夏自然科學(xué)基金（編號(hào)：2019A0040）。

作者簡介：方偉敏（1997—），男，福建漳州人，研究方向葡萄與葡萄酒釀造。E-mail：fangweimin0505@sina.cn。

通信作者：趙會(huì)君，博士，講師，研究方向?yàn)橹参锟鼓嫔飳W(xué)。E-mail：zhaohuijun1022@163.com。

寧夏枸杞是寧夏回族自治區(qū)特色資源植物，寧夏枸杞中富含枸杞多糖、黃酮、多酚等多種成分，因此是藥食同源性功能保健食品，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值[1-4]。由于寧夏枸杞分布廣泛，對(duì)鹽堿、干旱、冷凍等環(huán)境脅迫具有極強(qiáng)的耐受性，在河北省沿海鹽堿地、新疆自治區(qū)、甘肅省等土壤貧瘠之地也得到了大面積引種種植，也是典型的植被恢復(fù)樹種和經(jīng)濟(jì)樹種[5]。

在植物抗逆機(jī)制中，抗氧化酶系統(tǒng)及其關(guān)鍵基因起到重要作用[6]，超氧化物歧化酶（SOD）一般可以分為Cu/Zn-SOD、Fe-SOD和Mn-SOD 3種，其關(guān)鍵基因Fe-SOD，Mn-SOD、Cu/Zn-SOD的高效表達(dá)，是保持SOD酶活性的主要因素，SOD酶基因能夠受重金屬、鹽堿以及干旱等逆境環(huán)境的誘導(dǎo)而高效表達(dá)[7]。過氧化物酶（POD）主要是在植物受到迫害產(chǎn)生過氧化物時(shí)具有防御性的一種酶，細(xì)胞壁為首先受到重金屬脅迫的部位，POD酶作為可以調(diào)節(jié)細(xì)胞壁代謝的一種酶，可以減輕植株受迫害的程度，同時(shí)，POD酶還參與細(xì)胞壁木質(zhì)素形成和細(xì)胞凋亡等生理活動(dòng)[8-10]。過氧化氫酶（CAT）是一種金屬合成酶，其主要作用是使過氧化氫分解成氧和水，CAT也參了植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)[11]。

由于寧夏枸杞是異花授粉，遺傳背景復(fù)雜，自然環(huán)境中野生群體之間的抗逆差異較大，甚至現(xiàn)有栽培品種之間的抗逆能力也有很大差別[12]，而關(guān)于寧夏枸杞單一遺傳背景下組培苗的抗逆研究報(bào)道較少，在短期內(nèi)要獲得大量遺傳背景單一的群體，須要建立寧夏枸杞的快繁體系，已有很多關(guān)于寧夏枸杞組培體系的報(bào)道[13-14]，但是通過愈傷誘導(dǎo)的方法會(huì)產(chǎn)生大量的玻璃化苗，并且試驗(yàn)周期太長。本試驗(yàn)以無菌枸杞實(shí)生苗為材料，以不同的組織為外植體，擬建立、優(yōu)化無菌枸杞苗的組織培養(yǎng)快速繁殖體系，降低枸杞苗外植體褐化死亡率，降低枸杞外植體玻璃化率，縮短培養(yǎng)周期，通過對(duì)遺傳背景單一穩(wěn)定的組培苗的耐鹽能力的研究，能夠更加準(zhǔn)確地揭示枸杞的抗鹽機(jī)制，以期為寧夏枸杞組織培養(yǎng)快繁體系的建立和組培苗的鹽堿地生長提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料種植

所有試驗(yàn)都于北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。寧杞1號(hào)成熟飽滿的種子經(jīng)蒸餾水沖洗干凈后，于超凈臺(tái)中經(jīng)10%次氯酸鈉溶液消毒8 min后，用無菌水沖洗2～3遍，然后接種到1/2 MS培養(yǎng)基上，在25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)20 d左右時(shí)，莖尖和葉片組織接種于不同激素比例的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，用于愈傷及不定芽的誘導(dǎo)和遺傳轉(zhuǎn)化。

1.2 寧夏枸杞組培快繁體系的建立

將枸杞葉片及頂端生長點(diǎn)剪下（葉片經(jīng)手術(shù)刀劃傷）后接種于8種添加了不同激素的MS固體培養(yǎng)基中（pH值為6.0），激素配比見表1，每個(gè)處理重復(fù)5次，每個(gè)培養(yǎng)瓶中接種外植體20個(gè)，培養(yǎng)條件：溫度為25 ℃，濕度為40%，光照12 h/d。每 15 d 繼代1次，并記錄愈傷及不定芽生長情況，統(tǒng)計(jì)玻璃化率。

1.3 組培苗的生根

選取生長健康的不定芽為生根外植體，配制不同激素比例的生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，激素配比主要為1/2 MS+0.2 mg/L NAA （萘乙酸）+0.6 mg/L IBA（3-吲哚丁酸）、1/2 MS+0.2 mg/L NAA+0.2 mg/L IBA、1/2 MS+0.4 mg/L NAA+06 mg/L IBA以及MS培養(yǎng)基，20 d后觀察生根情況。

1.4 組培苗的水培及處理

選取在MS培養(yǎng)基中生根的組培苗，移栽在1/2 Hogland（霍格蘭）營養(yǎng)液中培養(yǎng)1周，換在全Hogland營養(yǎng)液中培養(yǎng)至10 cm高時(shí)用于抗氧化酶SOD、POD、CAT活性的測(cè)定及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

1.4.1 枸杞苗葉片中SOD、POD、CAT酶活性的測(cè)定

選取長勢(shì)均勻一致的水培枸杞苗，在Hogland營養(yǎng)液中分別設(shè)置3種不同濃度梯度的NaCl（0、100、200 mmol/L），每個(gè)處理重復(fù)3次，于處理24、48、72 h后取樣，分別稱取每個(gè)處理的新鮮成熟葉片各0.5 g于研缽中，加5 mL酶提取液在冰浴中研磨均漿，于4 ℃ 12 000 r/min 離心20 min，吸取上清液即為酶粗提液。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）的活性測(cè)定參考代其林等的方法[15-16]，每個(gè)處理重復(fù)3次，相關(guān)數(shù)據(jù)用軟件計(jì)算方差和平均值。

1.4.2 枸杞苗的RNA提取及cDNA合成

選取長勢(shì)均一的水培苗，經(jīng)200 mmol/L氯化鈉處理，于處理后0、2、12、24、48 h分別取新鮮葉片于液氮速凍，利用Invitrogen trizol試劑按照試劑盒說明書操作步驟提取總RNA并檢測(cè)完整性，取1 μg總RNA經(jīng)脫氧核糖核酸酶處理后用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（美國英杰生命技術(shù)有限公司）合成cDNA。

1.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的寧夏枸杞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫里的表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）序列，篩選了Cu/Zn-SOD、Fe-SOD、APX、GST等與抗氧化脅迫相關(guān)的基因，利用Primer Express 3.0 軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，采用美國MX3000pTM qPCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，以寧夏枸杞的β-actin基因作為內(nèi)參基因[17]，SYBR Green realtime PCR Master mix[東洋紡（上海）生物科技有限公司]為熒光染料，模板采用稀釋20倍的cDNA，重復(fù)3次，總反應(yīng)體系為 20 μL，反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析，所需引物序列見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素濃度處理對(duì)寧夏枸杞莖尖、下胚軸、葉片組織不定芽的誘導(dǎo)

由表3可知，寧杞1號(hào)的莖尖及葉片在不同激素濃度上的生長變化情況，經(jīng)過30 d誘導(dǎo)，莖尖在激素濃度為M7（1.0 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA）培養(yǎng)基中叢生芽芽點(diǎn)生長較多而幾乎沒有明顯的玻璃化情況，適合用于寧杞1號(hào)莖尖外植體不定芽的誘導(dǎo)，而葉片在M8（1.0 mg/L 6BA+0.4 mg/L NAA）培養(yǎng)基上經(jīng)過誘導(dǎo)后產(chǎn)生的不定芽生長最好，無明顯玻璃化，因此M8培養(yǎng)基可用于誘導(dǎo)葉片不定芽的形成。誘導(dǎo)的不定芽在MS培養(yǎng)基上就能快速完成生根，水培苗長勢(shì)健康正常（圖1）。

2.2 不定芽的快繁及生根

挑選5株叢生芽長勢(shì)較好的外植體，將其叢生芽獨(dú)立分開，分別進(jìn)行繼代培養(yǎng)，2周繼代1次，繼代3次后統(tǒng)計(jì)叢生芽數(shù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4。經(jīng)過2次繼代后快繁群體迅速增加，且快繁出的植株長勢(shì)良好，玻璃化率極低，因此，本試驗(yàn)所建立的快繁體系達(dá)到預(yù)期效果。將不定芽移栽在MS培養(yǎng)基上，經(jīng)過20 d的生根培養(yǎng)，不定芽完成了完整的形態(tài)建成，根系生長良好，移栽在Hogland 營養(yǎng)液中生長正常。

2.3 不同濃度的NaCl脅迫對(duì)葉片SOD、POD、CAT抗氧化酶活性的影響

組培苗在100、200 mmol/L NaCl處理下的葉片組織中的CAT、POD及SOD酶活性見圖2。

與CK相比，在不同濃度的NaCl脅迫下，CAT酶活性在100 mmol/L NaCl處理1 d后顯著性增加，隨著脅迫時(shí)間延長而下降，而POD酶活性在脅迫 3 d 后達(dá)到顯著或極顯著水平，SOD酶活性在 200 mmol/L 的NaCl處理1 d和2 d 后呈下降趨勢(shì)，但是在脅迫3 d后增加，但沒達(dá)到顯著水平。

2.4 不同濃度的NaCl 脅迫對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響

對(duì)4個(gè)與抗氧化脅迫相關(guān)的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，結(jié)果見圖3。與對(duì)照相比，APX基因在脅迫后48 h表達(dá)量顯著性增加，是對(duì)照的4.6倍;Cu/Zn-SOD基因在處理后24 h顯著增加，是對(duì)照的1.95倍，F(xiàn)e-SOD基因的表達(dá)在處理后12 h就已開始顯著被抑制，隨著時(shí)間延長，在48 h時(shí)極顯著降低，是對(duì)照的0.18倍，而GST基因隨著脅迫時(shí)間延長，表達(dá)倍數(shù)在24 h達(dá)到了最高，是對(duì)照的6.28倍，4個(gè)基因?qū)}堿脅迫進(jìn)行了積極響應(yīng)。

3 結(jié)論與討論

寧夏枸杞優(yōu)良的抗逆性機(jī)制目前仍然是研究的重點(diǎn)之一[5]，目前枸杞主要以扦插的方式進(jìn)行繁殖育種，而扦插受到自然環(huán)境等外界因素的影響。通過建立穩(wěn)定優(yōu)良的快繁體系，不僅可以保留枸杞原有的優(yōu)良性狀，也可以在短期內(nèi)獲得大量遺傳背景單一的無性系，為后期的基礎(chǔ)理論研究和育種提供理論和技術(shù)支持。

本研究選擇寧杞1號(hào)無菌實(shí)生苗的莖尖和葉片為試驗(yàn)材料，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，利用不同濃度配比的激素進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，篩選出不同外植體組織培養(yǎng)快速繁殖過程中適宜的培養(yǎng)基和激素濃度配比， 確定了MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA為莖尖生長點(diǎn)不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基濃度，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA為葉片不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，葉片或莖尖可以不通過愈傷再分化途徑就可以培養(yǎng)產(chǎn)生不定芽，并進(jìn)一步篩選到了最適不定芽增殖的培養(yǎng)基，大大地降低了玻璃化率，縮短了組培時(shí)間，不定芽最后經(jīng)MS培養(yǎng)基培養(yǎng)就可以快速生根。

經(jīng)過對(duì)這些遺傳背景單一的組培苗進(jìn)行鹽堿脅迫，發(fā)現(xiàn)POD酶活性在葉片中存在極顯著增加，表明POD在植物響應(yīng)鹽堿脅迫、清除過氧化物質(zhì)的過程中起重要的作用，而CAT酶活性在葉片中隨著時(shí)間延長都呈下降趨勢(shì)，眾多研究發(fā)現(xiàn)，隨著鹽堿濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長，CAT酶活性呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)[18]，高鹽濃度顯著抑制了CAT酶活性[9]。沈金玲等研究結(jié)果表明，鹽脅迫下部分CAT酶基因的表達(dá)倍數(shù)降低[19]，因此推測(cè)，可能由于鹽脅迫降低了CAT酶基因的表達(dá)倍數(shù)，從而影響了CAT酶的整體活性，這有待于后期繼續(xù)研究;通過對(duì)SOD酶的2個(gè)基因的表達(dá)模式進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，Cu/Zn-SOD在脅迫后24 h顯著性增加，而 Fe-SOD 基因卻呈現(xiàn)被極顯著抑制的趨勢(shì)，這可能是導(dǎo)致SOD酶活性不高的主要原因之一。有研究表明，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶參與了植物對(duì)多種逆境脅迫的響應(yīng)[20]，劉明坤通過將GST基因轉(zhuǎn)入煙草中，顯著提高了轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性，GST和APX基因表達(dá)倍數(shù)極顯著增加，暗示該基因能積極響應(yīng)鹽脅迫，可能在枸杞耐受鹽堿脅迫中起到重要作用[21]。

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