欒海蓉 代海兵 魏 韜 李 麗 王得利

牡丹江醫(yī)學院機能學教研室，黑龍江牡丹江 157011

缺血的組織器官恢復血流灌注后，不但不能使其功能和結構恢復，反而加重其功能障礙和結構損傷的現(xiàn)象稱為缺血-再灌注損傷（ischemiareperfusion injury，I/RI）[1-5]。槲 寄 生[拉 丁 學 名：Viscum coloratum（Kom.）Nakai]是我國的傳統(tǒng)中藥，對心血管系統(tǒng)具有一定的保護作用[6-7]。遠程缺血后適應（remote ischemic post-conditioning，RIPOC）是近年提出的減少器官組織I/RI的比較新的理論和方法，RIPOC操作無創(chuàng)、簡單易行，有潛在的臨床應用價值[8-12]。本研究通過建立大鼠I/RI的模型，將槲寄生有效提取物和RIPOC聯(lián)合應用，探究兩種干預措施對I/RI心肌的保護作用及機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

健康成年雄性SD大鼠50只，8～10周齡，體重250～300 g，牡丹江醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物合格證號 SYXK（黑）2019-006。實驗過程嚴格按照動物倫理要求處置實驗動物。

1.2 藥品、試劑與儀器

槲寄生有效提取物的制備方法見文獻[13]。10%水合氯醛（300 mg/kg，上海山浦化工有限公司），CK試劑盒、CK-MB試劑盒、LDH試劑盒（南京建成生物工程生物公司）。BL-420E多功能生物信號采集系統(tǒng)、HX-100E小動物呼吸機（成都泰盟科技有限公司）。

1.3 建立心肌缺血再灌注損傷（I/RI）模型

10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔麻醉SD大鼠，仰臥位固定。連接BL-420E多功能生物信號采集系統(tǒng)，持續(xù)監(jiān)測心電圖（electrocardiogram，ECG）Ⅱ導聯(lián)及心率（HR）變化。頸胸部備皮，消毒，行氣管插管術，連接小型動物呼吸機進行人工通氣。

左側胸前術區(qū)沿第4肋骨向腋窩走行方向切開皮膚，鈍性分離肋間肌層2～3 cm，進入胸腔，迅速將心臟擠出胸腔，識別冠狀動脈左前降支（left anterior descending，LAD），并用 6-0不可吸收縫合線將其結扎?？p線打結時放置一根“10”號絲線協(xié)助壓迫造成心肌缺血，30 min后剪斷線結行再灌注 120 min。I/RI模型成功的標準：心電圖ST段抬高和（或）T弓背向上，左室前壁顏色逐漸變白，表示造模成功。

1.4 分組及干預給藥

50只SD大鼠 隨機分為5組，每組各10只：①Sham組：LAD下方穿線不結扎，連續(xù)觀察 150 min。②I/RI組：冠脈結扎30 min后再灌注 120 min。③槲寄生組：灌胃給予槲寄生有效提取物（300 mg/kg），1 次 /d，連續(xù)14 d，最后一次結束后結扎冠狀動脈，30 min后剪斷絲線復灌120 min。④RIPO組：冠狀動脈結扎30 min后，對大鼠左后肢使用止血帶做3周期5 min缺血/5 min 再灌注處理，然后復灌120 min。⑤聯(lián)合組（槲寄生+RIPOC組）：每日灌胃給藥同槲寄生組，最后一次結束后結扎冠狀動脈造成心肌缺血30 min后，再進行RIPOC干預，最后復灌120 min。Sham組、I/RI組與 RIPOC 組灌胃等量0.9%氯化鈉溶液，均持續(xù)干預 14 d。

1.5 觀察指標

監(jiān)測血流動力學及ECG變化：全程監(jiān)測并記錄開胸前基礎值（T0），缺血10min（T1），缺血30 min（T2），再灌注30 min（T3），再灌注60 min（T4），再灌注120 min（T5）不同時間段的HR和平均動脈壓（MAP）。

血清生化指標測定：再灌注120 min后，靜脈采血1～2 ml，置于抗凝試管并靜置室溫20 min后，離心機上3500 轉/min，離心10 min后吸取上清血清置入滅菌離心管中，并保存于-20℃冰箱中，測定血清血清肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶心肌型同工酶（creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB）、乳酸脫氧酶（iactic dehydrogenase，LDH）含量。

心肌梗死程度：收集血液標本后，迅速打開胸腔再次結扎LAD，經(jīng)頸內靜脈注入1%伊文氏藍1～2 ml染色（正常心肌被染成藍色，缺血心肌不著色）。3 min 后將心臟剪下，-20℃冰箱冰凍1 h后，切成1.0～2.0 mm厚的薄片，置于1% TTC中，37℃溫育 30 min。其中白色部位表示心肌梗死區(qū)（infarct size，IS），紅色和白色代表心肌缺血區(qū)（area at rist，AAR），藍色表示正常心肌組織即非缺血區(qū)，LV代表左心室（left ventricle，LV）。吸干水分后稱取各區(qū)重量。缺血程度用缺血區(qū)重量/左心室重量（AAR/LVg）表示；梗死程度用梗死區(qū)重量/缺血區(qū)重量（IS/AARg）表示。

1.6 統(tǒng)計學處理

所有資料均采取SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠不同時間點HR的比較

I/RI組與各干預組大鼠的HR隨時間推移均有所下降（P＜0.01）。T1至T5時刻，與 Sham 組比較，I/RI 組HR降低明顯（P＜0.01）；與I/RI 組比較，T2至T5時刻，各干預組HR相對較高（P＜0.05，P＜0.01）；T3至T5，聯(lián)合組大鼠的HR高于槲寄生組和RIPOC組（P＜0.01）。見表 1。

2.2 各組大鼠不同時間點MAP的比較

T2至T5時刻，與 Sham 組比較，I/RI組血壓明顯下降（P＜0.01）；與 I/RI組比較，T2至T5時刻，各干預組大鼠血壓相對較高（P＜0.01）。T3至T5時刻，聯(lián)合組大鼠的血壓高于槲寄生組和RIPOC組（P＜0.01）。見表2。

表1 各組大鼠不同時間點的HR比較（±s，次/min）

表1 各組大鼠不同時間點的HR比較（±s，次/min）

注：與Sham 組比較，aP＜0.01；與I/RI組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與聯(lián)合組比較，dP＜0.01

組別 n T0 T1 T2 T3 T4 T5 F值 P值Sham 組 10 386±9 380±4 391±10 390±6 388±11 382±3 2.347 ＞0.05 I/RI組 10 389±12 364±10a 361±3a 358±2a 361±8a 339±9a 29.480 ＜0.01槲寄生組 10 388±11 362±10 362±3b 370±4cd 368±5bd 356±4cd 17.460 ＜0.01 RIPOC組 10 387±11 362±7 365±4b 372±7cd 369±6bd 358±8cd 14.744 ＜0.01聯(lián)合組 10 386±9 361±4 368±8b 383±11c 377±5c 370±4c 13.159 ＜0.01 F值 0.169 34.975 11.109 32.509 19.451 73.917 P值 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表2 各組大鼠不同時間點的MAP比較（±s，mmHg）

表2 各組大鼠不同時間點的MAP比較（±s，mmHg）

注：與Sham 組比較，aP＜0.01；與I/RI組比較，bP＜0.01；與聯(lián)合組比較，cP＜0.01

組別 n T0 T1 T2 T3 T4 T5 F值 P值Sham 組 10 104±5 106±3 105±6 103±3 101±5 100±6 2.087 ＞0.05 I/RI組 10 107±3 108±2 96±4a 75±3a 77±4a 65±3a 270.607 ＜0.01槲寄生組 10 105±4 110±3 100±3b 90±3bc 82±3bc 79±2bc 125.216 ＜0.01 RIPOC組 10 105±4 110±3 101±4b 88±5bc 85±4bc 82±3bc 71.578 ＜0.01聯(lián)合組 10 106±3 109±4 100±3b 95±3b 93±3b 88±5b 36.603 ＜0.01 F值 0.867 1.913 4.527 62.997 60.901 87.527 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表3 各組大鼠再灌注120 min后血清酶濃度比較（±s，U/L）

表3 各組大鼠再灌注120 min后血清酶濃度比較（±s，U/L）

注：與Sham 組比較，aP＜0.01；與I/RI組比較，bP＜0.01；與聯(lián)合組比較，cP＜0.01

組別 n CK CK-MB LDH Sham 組 10 1033.52±72.77 192.55±28.40 312.79±29.82 I/RI組 10 12937.55±746.66a 1238.35±105.18a 1977.35±137.36a槲寄生組 10 8138.75±86.69bc 753.45±67.58bc 1105.72±83.56bc RIPOC組 10 8235.70±178.14bc 789.33±62.71bc 1059.13±59.35bc聯(lián)合組 10 6371.14±187.34b 592.35±42.60b 785.32±26.40b F值 1297.481 320.565 536.036 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 各組大鼠血清生化指標的比較

與Sham組比較，I/RI組大鼠血清酶CK、CK-MB、LDH濃度均升高明顯（P＜0.01）。與I/RI組比較，各干預組大鼠的三種血清酶濃度均有所降低（P＜0.01）。聯(lián)合組大鼠的血清酶濃度低于槲寄生組和RIPOC組（P＜0.01）。見表3。

2.4 各組大鼠心肌缺血程度和梗死程度的比較

各組大鼠的心肌缺血程度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與I/RI組比較，各干預組大鼠的梗死程度均明顯降低（P＜0.01）。聯(lián)合組梗死程度小于槲寄生組和RIPOC組（P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠缺血程度和梗死程度比較（±s，%）

表4 各組大鼠缺血程度和梗死程度比較（±s，%）

注：與I/RI組比較，aP＜0.01；與聯(lián)合組比較，bP＜0.01

組別 n 缺血程度 梗死程度Sham 組 10 - -I/RI組 10 57.15±0.16 55.07±0.37槲寄生組 10 56.97±0.31 45.47±0.37ab RIPOC組 10 56.89±0.68 43.25±0.21ab聯(lián)合組 10 56.87±0.61 18.64±0.34a F值 0.684 22231.041 P值 ＞0.05 ＜0.01

3 討論

槲寄生是我國傳統(tǒng)常用中藥材[14-17]，其對心血管系統(tǒng)的作用已成為研究熱點。RIPOC作為一種非藥物治療方法，在冠脈溶栓、心臟手術等領域有巨大的臨床應用價值[18-19]。結果顯示，在T2至T5時刻，與I/RI組相比，槲寄生、RIPOC或者二者聯(lián)合干預下，都能改善I/RI大鼠的HR，還可以平穩(wěn)血壓，聯(lián)合組效果優(yōu)于槲寄生組和RIPOC組。

CK-MB、CK、LDH 的血清濃度常作為心肌I/RI的診斷性標志物，用來評價心肌細胞損傷程度[20-23]。結果顯示，I/RI組的 CK-MB、CK及 LDH濃度較缺血前明顯升高，說明I/RI對大鼠心肌細胞產(chǎn)生了嚴重的損傷；再灌注 120 min后，與I/RI組相比，槲寄生組和RIPOC組的CK、CK-MB及LDH 濃度明顯降低，均可減輕心肌細胞的損傷和壞死，聯(lián)合組大鼠的血清酶濃度明顯低于槲寄生組和RIPOC組。

心肌梗死程度的測定是評估心肌各種干預措施是否有效的重要標準之一。與 I/RI組相比，槲寄生、RIPOC都能減輕心肌細胞的損傷，心肌梗死程度明顯減少，聯(lián)合組梗死程度最輕，明顯小于槲寄生組和RIPOC組。

綜上所述，槲寄生和RIPOC兩種干預方式聯(lián)合應用，可以最大程度改善I/RI心肌的血流供應，減少心肌酶的釋放，減少再灌注后心肌損傷，具有一定的協(xié)同保護作用。