李曉華，李 潔，唐軍偉

(四川省南充市中心醫(yī)院/川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院老年病科，四川 南充 637000)

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率均居首位的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，50%患者發(fā)病年齡在65歲以上，其中非小細胞肺癌(non small cell Lung cancer,NSCLC)在肺癌患者中約占近80%[1]。NSCLC早期無特異性表現(xiàn)，臨床上絕大多數(shù)患者確診時已到達晚期，錯失了手術(shù)的最佳治療時機而只能進行姑息性放化療，療效不甚滿意。因此，早期對老年NSCLC患者治療療效的準確評估對于及時調(diào)整治療方案和預(yù)后的改善具有重要的臨床意義。研究[2]指出，外周血循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)數(shù)目與NSCLC放化療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有重要聯(lián)系。神經(jīng)元特異性稀醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)是在肺腺癌和鱗癌患者血清中異常升高表達的一種血清腫瘤標志物，可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)[3]；細胞質(zhì)胸苷激酶-1(Cytoplasmic Thymidine Kinase-1,TK-1)和中期因子(Midkine,MK)均是被研究證實與NSCLC發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的血清腫瘤標志物，但其與NSE和CTCs在評估老年NSCLC患者化療后療效中的價值尚未見相關(guān)研究報道。基于此，本研究探討老年NSCLC患者外周血CTCs和血清NSE、TK-1、MK的表達水平及其與臨床療效的相關(guān)性，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:前瞻性選取2017年9月至2019年2月期間于我院收治的86例經(jīng)病理檢查證實的老年NSCLC患者作為研究對象，86例患者中男性49例，女性37例，年齡60～89歲，平均年齡(74.32±13.57)歲；病理類型為腺癌51例，鱗癌32例，腺鱗癌2例，大細胞癌1例；病理分期Ⅲ期41例，Ⅳ期45例；高分化12例，中分化34例，低分化40例。納入標準：①符合2016年版《中國晚期原發(fā)性肺癌診治專家共識》[4]中NSCLC的診斷標準，結(jié)合刺激性干咳、咯血、胸痛、發(fā)熱、氣促等癥狀，血清腫瘤標志物癌胚抗原、糖類抗原125等指標異常，CT或MRI影像學(xué)檢查，并經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為NSCLC者；②腫瘤TNM分期Ⅲ～Ⅳ期者；③術(shù)前未接受放、化療或分子靶向治療者；④預(yù)計生存期大于3個月者；⑤入院時血常規(guī)及心、肝、腎功能檢查均正常，對化療可耐受，且能在院接受≥2個周期化療者。排除標準：①合并嚴重心、肝、腎功能障礙、免疫系統(tǒng)疾病者；②合并其他惡性腫瘤、血液系統(tǒng)疾病者；③精神、認知障礙等無法配合治療者；④出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移等遠處轉(zhuǎn)移者。本研究在獲得醫(yī)院倫理委員會審核批準后實施，患者均知情參與本研究。

1.2方 法

1.2.1治療方法:所有患者均接受多西他賽+順鉑的化療方案，在化療第1天給予患者多西他賽75mg/m2靜滴1h；化療第1～3d給予患者順鉑25mg/m2靜滴，以21d為1個周期，兩個療程之間間隔7d，連續(xù)化療6個周期。治療期間均給予常規(guī)預(yù)防胃腸道反應(yīng)、抗過敏、止吐等對癥處理。

1.2.2療效評估:治療前后，依據(jù)《實體瘤療效評價標準》[5]對患者治療效果進行評估，其中完全緩解(CR)：腫瘤病灶徹底消失，無新病灶出現(xiàn)，腫瘤最長徑縮小≥50%，并維持4周以上；部分緩解(PR)：腫瘤病灶的直徑綜合低于基線≥30%；疾病穩(wěn)定(SD)：病灶兩徑最大垂直經(jīng)乘積增大或減小<25%，未出現(xiàn)新病灶；疾病進展(PD)：病灶兩徑乘積的增大量≥25%或有新病灶出現(xiàn)。治療有效=(CR+PR)，無效=(SD+PD)。

1.2.3外周血CTCs檢測:化療采集患者外周血7.5mL入Cell Save管，充分混勻后，采用強生公司的Cell-Search自動化檢測系統(tǒng)，采用免疫磁珠方法富集表達上皮細胞黏附分子的上皮細胞，所富集的細胞經(jīng)固定、透化等處理后采用角蛋白Cytokerins抗體、CD45抗體進行免疫染色，最后經(jīng)4，6-二脒基-2-苯基吲哚染色完成后，采用多通道熒光顯微鏡分析、鑒定細胞核，并計數(shù)，CTCs細胞特征為CK(+)/DAPI(+)/CD45(-)。將CTCs計數(shù)>2個判定為CTCs陽性，≤1個判定為CTCs陰性。

1.2.4血清NSE、TK-1、MK檢測:化療前采集患者3～5mL清晨空腹靜脈血，經(jīng)離心分離血清后取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法對患者血清中的NSE、TK-1、MK水平進行檢測，試劑盒購自賽默飛世爾公司。NSE正常值≤5.2ng/mL。

2 結(jié) 果

2.186例老年NSCLC患者治療后臨床療效情況:本研究中86例老年NSCLC患者均順利完成化療，化療后有49例治療有效，包括CR9例和PR40例，治療總有效率為56.98%，為治療有效組；37例患者治療無效，包括SD18例和PD19例，占比43.02%，為無效組。

2.2兩組患者CTCs陽性率及血清NSE、TK-1、MK水平比較:經(jīng)檢測后，無效組血清NSE、TK-1、MK水平和CTCs陽性率均明顯高于有效組(P<0.05)，見表1。經(jīng)相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CTCs陽性率與血清NSE、TK-1、MK的表達存在明顯的正相關(guān)性(r=0.703、0.685、0.619，均P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者CTCs陽性率及血清NSE TK-1 MK水平比較

2.3老年NSCLC患者化療后無效的單因素分析:結(jié)果顯示，兩組在年齡、性別、腫瘤直徑、吸煙史和合并疾病方面比較無明顯差異(P>0.05)，兩組在腫瘤TNM分期、外周血CTCs、血清NSE、TK-1、MK表達方面存在明顯差異(P<0.05)，見表2。

表2 老年NSCLC患者化療后無效的單因素分析n(%)

2.4影響NSCLC患者化療后無效的多因素Logistic回歸分析:以老年NSCLC患者化療后無效作為因變量(治療有效=0，治療無效=1)，將單因素中差異存在統(tǒng)計學(xué)意義的因素(腫瘤TNM分期、外周血CTCs、血清NSE、TK-1、MK表達)作為自變量，并進行賦值，見表3。隨后將其納入Logistic回歸模型中，結(jié)果顯示外周血CTCs陽性、NSE≥40.0ng/mL、TK-1≥4.5pmoL/L和MK≥0.8ng/mL是老年NSCLC患者化療后無效的獨立預(yù)測因素，見表4。

表3 NSCLC患者化療后無效的多因素分析賦值表

表4 影響老年NSCLC患者化療后無效的多因素Logistic回歸分析

2.5血清NSE、TK-1、MK預(yù)測老年NSCLC患者化療后無效的ROC曲線分析:結(jié)果顯示，血清NSE、TK-1、MK單獨預(yù)測老年NSCLC患者化療后無效的ROC曲線下面積分別為0.767、0.735和0.734，均低于三指標聯(lián)合預(yù)測的ROC曲線下面積0.889(P<0.05)；且血清NSE、TK-1、MK單獨預(yù)測老年NSCLC患者化療后無效時的截斷值分別為：45.60ng/mL、4.78pmoL/L和1.18ng/mL，見圖1，表5。

表5 血清NSE TK-1 MK評估患者療效的ROC曲線下面積

圖1 血清NSE、TK-1、MK評估療效的ROC曲線

3 討 論

CTCs是由于診療操作或自發(fā)等原因經(jīng)血管或淋巴系統(tǒng)進入血液循環(huán)的腫瘤細胞，是腫瘤發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的重要條件，已被研究證實與NSCLC患者的臨床病理及總生存期具有重要的相關(guān)性[6]。血清腫瘤標志物是指腫瘤在發(fā)生和發(fā)展過程中產(chǎn)生或分泌并釋放到外周中的一種肽類物質(zhì)，其血清檢測可用于惡性腫瘤的診斷、療效評估和預(yù)后。目前，在NSCLC的腫瘤標志物中，NSE、TK-1和MK是臨床上較為常用且較有價值的血清腫瘤標志物，但單一的血清指標檢測具有一定的局限性，臨床上常采用聯(lián)合檢測的手段以提高其血清腫瘤標志物的應(yīng)用價值。本研究主要探討了外周血CTCs和血清NSE、TK-1、MK與老年NSCLC患者臨床療效的關(guān)系，對于臨床上指導(dǎo)老年NSCLC患者化療方案的制定具有重要作用。

本研究中經(jīng)6個月化療，有43.02%的老年NSCLC患者治療后無效，由于86例NSCLC患者均為晚期患者，臨床治療以化療為主，與既往文獻中晚期NSCLC化療的有效率不高，約在30%～50%的報道較為一致[7]。比較無效組和有效組患者的CTCs和血清腫瘤標志物水平發(fā)現(xiàn)，無效組血清NSE、TK-1、MK水平和CTCs陽性率均明顯高于有效組，可見CTCs在NSCLC化療后無效患者外周血中呈較高陽性表達率，且血清NSE、TK-1、MK呈較高表達，與國內(nèi)的研究結(jié)果較為一致[8]。本研究中，老年NSCLC化療后無效的多因素分析結(jié)果顯示，外周血CTCs陽性、NSE≥40.0ng/mL、TK-1≥4.5pmoL/L和MK≥0.8ng/mL是老年NSCLC患者化療后無效的獨立預(yù)測因素。可見，CTCs的高陽性率及血清NSE、TK-1、MK的高表達均與老年NSCLC化療后無效具有重要聯(lián)系。轉(zhuǎn)移是腫瘤化療失敗的重要原因，研究指出[9]，CTCs的存在為惡性腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移發(fā)展和增殖創(chuàng)造了條件。茍小麗等[10]研究亦發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌CTCs陽性率與NSCLC患者療效和預(yù)后呈負相關(guān)。因而，可以認為，CTCs數(shù)目及陽性率可間接反映晚期NSCLC患者體內(nèi)腫瘤的負荷情況和機體免疫清除能力，對于評估晚期老年NSCLC患者療效和預(yù)后具有重要指導(dǎo)作用。進一步的ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清NSE、TK-1、MK單獨預(yù)測老年NSCLC患者化療后無效的ROC曲線下面積均低于三指標聯(lián)合預(yù)測的ROC曲線下面積，可見以上三項血清腫瘤標志物的聯(lián)合檢測對老年NSCLC患者化療后療效的評估具有更高的應(yīng)用價值。NSE是一種在神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞中特異存在的糖酵解酶，已被研究證實在NSCLC患者血清中的水平隨著腫瘤的進展而逐漸升高[11]，因而當(dāng)老年NSCLC患者血清NSE≥40.0ng/mL時，提示老年NSCLC患者化療后失敗的風(fēng)險較高。TK-1是能催化胸腺嘧啶核苷轉(zhuǎn)變成單磷酸胸腺嘧啶的一種血清腫瘤標志物，其在NSCLC患者血清中異常高表達與腫瘤組織細胞劇烈增殖有關(guān)[12]。TK-1是多種癌癥的診斷和預(yù)測指標，當(dāng)TK-1≥4.5pmoL/L時患者體內(nèi)腫瘤組織細胞增殖劇烈，即使經(jīng)過6個周期的化療，其化療后仍存在較大的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險，導(dǎo)致化療失敗。MK是一種肝素結(jié)合生長因子，在多種惡性腫瘤細胞中高表達。血清MK升高導(dǎo)致的老年NSCLC患者化療后無效的原因可能與高表達的MK促使腫瘤持續(xù)生長浸潤以及促進腫瘤血管生成有關(guān)。因此，血清NSE、TK-1和、MK的較高表達和外周血CTCs高陽性表達率均會增加NSCLC患者化療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，導(dǎo)致化療失敗，進一步可說明CTCs陽性率與血清NSE、TK-1、MK的表達分別互為正相關(guān)關(guān)系，這與本研究中四項指標相關(guān)性分析的結(jié)果一致。本研究中血清NSE、TK-1、MK的聯(lián)合預(yù)測對于老年NSCLC患者化療后療效的評估價值更高，可幫助老年晚期NSCCL患者預(yù)測化療后是否治療有效進而指導(dǎo)制定治療方案，具有較好的應(yīng)用價值

綜上所述，外周血CTCs高陽性表達率和血清NSE、TK-1、MK高表達是NSCLC患者化療后無效的重要影響因素，且血清三項聯(lián)合檢測對于評估NSCLC患者化療后療效具有較好的應(yīng)用價值。因而臨床上可通過聯(lián)合檢測患者外周血CTCs和血清腫瘤標志物以篩選化療后無效的高風(fēng)險人群，并制定和調(diào)整治療方案，以改善患者預(yù)后。