周 易, 李火平, 夏光明, 周 帆, 金朝霞, 張 慧

(湖北省黃岡市中心醫(yī)院/長(zhǎng)江大學(xué)附屬黃岡醫(yī)院，湖北 黃岡 438000)

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI )是指由嚴(yán)重感染、休克、創(chuàng)傷及燒傷等非心源性致病因素導(dǎo)致的急性進(jìn)行性呼吸衰竭，臨床表現(xiàn)為呼吸頻數(shù)和呼吸窘迫。ALI早期即可出現(xiàn)纖維化改變，臨床治療藥物及其效果有限。黃芪味甘性溫，歸肺、脾經(jīng)，是一種重要的補(bǔ)氣藥，對(duì)急性肺損傷肺纖維化有明顯的抑制作用[1]。同時(shí)有研究表明，阿托伐他汀能通過(guò)多種途徑發(fā)揮對(duì)急性肺損傷的的保護(hù)作用[2]。但兩者合用對(duì)急性肺損傷肺纖維化的治療鮮有報(bào)道。本課題擬以病理學(xué)觀(guān)察為依據(jù)，驗(yàn)證黃芪聯(lián)合阿托伐他汀對(duì)肺纖維化的保護(hù)作用，同時(shí)闡述其對(duì)細(xì)胞黏附功能可能的影響機(jī)制，為臨床治療肺損傷肺纖維化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料:Wistar大鼠60只，雌雄不限，體重200～240g，由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。黃芪注射液購(gòu)自成都地奧制藥有限公司、阿托伐他汀鈣片購(gòu)自輝瑞公司、博來(lái)霉素購(gòu)自日本化藥株式會(huì)社。HyP試劑盒購(gòu)自合肥萊爾。TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及PECAM-1多克隆抗體免疫組化試劑盒由武漢博士德生物提供。其他儀器設(shè)備均由長(zhǎng)江大學(xué)附屬黃岡市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心和病理科提供。本課題通過(guò)了院倫理委員會(huì)審查。

1.2動(dòng)物模型制備與分組給藥:模型制備：大鼠48只隨機(jī)分為四組，每組12只，用氯胺酮麻醉后，博萊霉素注入大鼠肺內(nèi)，制備急性肺損傷肺纖維化模型(經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)模型制備成功)，另外12只大鼠用同樣方法注入同體積生理鹽水，制備假手術(shù)模型。分組給藥：黃芪組和聯(lián)合組每天腹腔注射給予1.0mL·kg-1·d-1的黃芪注射液，他汀組和聯(lián)合組給予阿托伐他汀20mg·kg-1·d-1灌胃；同時(shí)對(duì)照組、模型組和他汀組給予腹腔注射等量生理鹽水；對(duì)照組、模型組和黃芪組給予等量生理鹽水灌胃。各組于第14天給藥6h后處死大鼠，并迅速取出肺組織待測(cè)。

1.3觀(guān)察指標(biāo)

1.3.1肺組織病理學(xué)檢查及評(píng)分:將標(biāo)本常規(guī)處理后，HE染色光鏡下觀(guān)察組織病理學(xué)改變及肺泡炎程度，Masson染色觀(guān)察肺纖維化程度。參照文獻(xiàn)[3]方法確定肺泡炎和肺纖維化的病變程度并進(jìn)行評(píng)分。同時(shí)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀(guān)察黏附分子陽(yáng)性表達(dá)情況(以光鏡下觀(guān)察到的棕黃色顆粒為黏附分子陽(yáng)性表達(dá))。

1.3.2各組HyP、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1表達(dá)水平測(cè)定:采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，ELISA法測(cè)定HyP、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1水平，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1各組肺組織病理學(xué)檢查情況:對(duì)照組：肺組織結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)纖維化病理改變，少許棕黃色表達(dá)。模型組：正常肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增厚，見(jiàn)膠原纖維增生及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，形成廣泛性纖維化，棕黃色顆粒顯著增多。黃芪組或他汀組：與同期模型組相比，肺間質(zhì)部分有小灶狀，纖維化程度有所減輕，病變范圍較同期的模型組明顯縮小，棕黃色顆粒表達(dá)有所減輕。聯(lián)合組：病變范圍及纖維化減輕更為明顯，棕黃色顆粒陽(yáng)性表達(dá)減少明顯。見(jiàn)圖1、圖2及圖3。

圖1 各組肺泡炎染色圖片(HE×200)

圖2 各組肺纖化染色圖片(Masson×200)

圖3 各組肺組織黏附分子表達(dá)(免疫組化×200)

2.2各組肺泡炎和肺纖維化分級(jí)評(píng)分情況:與對(duì)照組比較，肺損傷后各組肺泡炎和肺纖維化分級(jí)評(píng)分顯著升高(P<0.05)，給予黃芪或阿托伐他汀處理后評(píng)分均降低(P<0.05)，且聯(lián)合組降低更明顯(P<0.05)，見(jiàn)表1、圖1及圖2。

表1 各組病理學(xué)評(píng)分及HyP TNF-α ICAM-1 VCAM-1表達(dá)比較

2.3各組肺組織HyP、TNF-α和ICAM-1、VCAM-1、PECAM-1表達(dá)測(cè)定:肺損傷肺纖維化后各組HyP、TNF-α和ICAM-1、VCAM-1、PECAM-1表達(dá)明顯升高(P<0.05)，但黃芪或阿托伐他汀處理后顯著降低(P<0.05)，且聯(lián)合用藥后效果更為明顯(P<0.05)，見(jiàn)表1。

3 討 論

肺纖維化是許多肺部疾病的結(jié)局，是一種高度致命的疾病，可由各種已知的損傷，如感染、過(guò)敏原、毒素或輻射等引發(fā)。研究表明ALI早期即可出現(xiàn)纖維化改變，然而導(dǎo)致肺纖維化的細(xì)胞機(jī)制尚不清楚，但通常認(rèn)為是肺泡上皮持續(xù)的損傷導(dǎo)致失調(diào)修復(fù)[4]。從肺組織病理學(xué)改變及肺泡炎和肺纖維化分級(jí)評(píng)分可知，模型組、他汀組、黃芪組及聯(lián)合組肺泡炎和肺纖維化明顯(P<0.05)，但用藥后14d，各治療組肺泡炎及纖維化程度明顯較輕(P<0.05)，其中聯(lián)合組最為顯著(P<0.05)，說(shuō)明黃芪注射液聯(lián)合阿托伐他汀對(duì)肺泡炎及肺纖維化具有明顯的保護(hù)作用，且優(yōu)于單獨(dú)使用。

肺纖維化是正常的肺組織被異常積累的成纖維細(xì)胞和膠原所取代。HyP在膠原中的比例相對(duì)恒定(約占13%)，是膠原蛋白的主要成分之一，在其它蛋白中較少或不存在，因此測(cè)定羥脯氨酸水平可反映膠原水平，也可間接反應(yīng)肺纖維化的程度。TNF-α主要是由T細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生和釋放，其在炎癥中的作用機(jī)制主要是對(duì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)(是一種強(qiáng)有力的誘導(dǎo)劑)、增強(qiáng)氧化應(yīng)激、促進(jìn)炎性介質(zhì)的表達(dá)和釋放以及對(duì)肺泡活性物質(zhì)功能的損害等。TNF-α能激活促纖維化細(xì)胞因子，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、趨化，缺乏TNF受體的小鼠能夠抵抗各種因素引起的肺纖維化[5]。從表1可知，HyP和TNF-α在肺損傷肺纖維化模型中表達(dá)明顯，他汀組、黃芪組及聯(lián)合組HyP和TNF-α表達(dá)水平均明顯下降，特別是聯(lián)合組下降更為明顯(P<0.05)，說(shuō)明黃芪聯(lián)合阿托伐他汀對(duì)肺纖維化組織HyP和TNF-α具有明顯的調(diào)節(jié)作用。

黏附分子是指存在于細(xì)胞表面，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間或細(xì)胞與基質(zhì)間相互接觸與結(jié)合的一類(lèi)膜表面糖蛋白，與白細(xì)胞穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞密切相關(guān)，主要包括ICAM-1、VCAM-1、PECAM-1等。目前認(rèn)為白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞緊密黏附是通過(guò)CD11/CD18-ICAM-1和VLA-4-VCAM-1兩條通路實(shí)現(xiàn)。中性粒細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密黏附以前者為主。在炎癥介質(zhì)作用下，中性粒細(xì)胞上調(diào)表達(dá)CD11/CD18，內(nèi)皮細(xì)胞上ICAM-1表達(dá)增強(qiáng)，從而使中性粒細(xì)胞通過(guò)CD11/CD18-ICAM-1通路不可逆的黏附到內(nèi)皮下。在組織中趨化因子作用下，穿內(nèi)皮細(xì)胞間隙到達(dá)炎癥區(qū)域，沿趨化因子梯度移行至細(xì)胞外基質(zhì)，最終白細(xì)胞經(jīng)基底膜與假?gòu)?fù)層柱狀上皮進(jìn)人氣道腔內(nèi)。其中在內(nèi)皮細(xì)胞連接處表達(dá)的PECAM-1介導(dǎo)這一過(guò)程。一旦中性粒細(xì)胞與肺泡內(nèi)皮、上皮或者與間質(zhì)中的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白接觸，細(xì)胞內(nèi)的毒性物質(zhì)如各種蛋白酶、氧自由基和細(xì)胞因子外誘捕網(wǎng)等物質(zhì)會(huì)被釋放出來(lái)，損傷肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮，最終導(dǎo)致ALI。同時(shí)單核細(xì)胞黏附與移行通過(guò)上述兩條通路均可進(jìn)行，VLA-4-VCAM-1可作為CD11/CD18-ICAM-1的替代途徑。單核吞噬細(xì)胞聚集，其細(xì)胞毒作用增強(qiáng)，加重肺損傷[6]。隨后肺損傷修復(fù)，間質(zhì)膠原增生，最終導(dǎo)致肺纖維化。同時(shí)氧化應(yīng)激或氧化信號(hào)也可能加重肺纖維化[7]。本研究可以看出，急性肺損傷肺纖維化各組ICAM-1、VCAM-1及PECAM-1明顯增強(qiáng)(P<0.05)，細(xì)胞黏附功能活躍，而使用阿托伐他汀和黃芪干預(yù)后其表達(dá)水平明顯下降，特別是聯(lián)合組下降更為明顯(P<0.05)，說(shuō)明黃芪聯(lián)合阿托伐他汀對(duì)肺纖維化組織細(xì)胞黏附功能具有明顯的調(diào)節(jié)作用。

阿托伐他汀為常用的抗血脂藥物，其抗肺損傷肺纖維化的機(jī)制主要有：①通過(guò)抗脂質(zhì)氧化保護(hù)作用來(lái)抑制炎性介質(zhì)釋放，降低氧化應(yīng)激，減輕肺組織炎性反應(yīng)[8]；②改善內(nèi)皮功能，抑制血管平滑肌的增殖和遷移，促進(jìn)炎癥吸收[9]；③抑制黏附分子表達(dá)，減少單核-巨噬細(xì)胞的黏附和分泌功能，減輕動(dòng)脈壁巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞的形成等[10]。同時(shí)研究證實(shí)黃芪具有明顯的抗缺氧、抗炎、鎮(zhèn)痛和調(diào)節(jié)免疫的功能，并能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子表達(dá)、改善血管內(nèi)皮等作用改善肺纖維化[1]。本研究表明黃芪聯(lián)合阿托伐他汀鈣能協(xié)同減輕肺損傷肺纖維化進(jìn)程，其機(jī)制可能與其能降低HyP和TNF-α含量以及調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附功能，減少白細(xì)胞的黏附以及與內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用，阻斷白細(xì)胞穿過(guò)血管內(nèi)皮游出到達(dá)炎癥部位，減輕其隨后釋放的一系列細(xì)胞物質(zhì)對(duì)肺泡及血管的損傷，從而抑制炎癥反應(yīng)達(dá)到抑制纖維化的效應(yīng)有關(guān)。