袁惠玲，吳麗華，陳桂林，黃珂銘

(廣東省東莞市人民醫(yī)院乳腺科, 廣東 東莞 523000)

三陰性乳腺癌(TNBC)是一種以雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人表皮生長因子受體-2(HER2)基因缺失為特征的高致死性乳腺癌亞群[1～3]。研究發(fā)現(xiàn)，不同基因表達(dá)譜的TNBC表現(xiàn)出高度不同的增殖和侵襲能力[1]。且可通過分析基因表達(dá)譜獲取TNBC的生物學(xué)和潛在的治療靶點[4]。最新研究表明，相比于非TNBC，TNBC表現(xiàn)出高度增殖和侵襲性增強(qiáng)的細(xì)胞生物學(xué)特征[5]。然而，目前對于TNBC乳腺癌的增殖性和侵襲性增強(qiáng)的原因尚未闡明。泛素樣含PHD和環(huán)指域1(UHRF1)是一種介導(dǎo)DNA表觀遺傳修飾的重要協(xié)調(diào)分子[6]。其通過識別靶基因的N端Ub樣和RING等識別結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)靶基因DNA甲基化參與乳腺癌等細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控[6～8]。早期研究發(fā)現(xiàn)，UHRF1在增殖的胚胎干細(xì)胞和癌細(xì)胞中高表達(dá)，且與細(xì)胞周期G1/S相變有關(guān)[9]。另外，UHRF1的mRNA和蛋白水平會隨著細(xì)胞周期而波動，而UHRF1的消耗會抑制S期進(jìn)入[10]。重要的是，UHRF1通過高度甲基化啟動子來抑制KLF17、MDR1和BRCA1表達(dá)，從而促進(jìn)乳腺癌發(fā)生發(fā)展[10,11]。然而，UHRF1在非TNBC和TNBC乳腺癌中的表達(dá)變化及對其增殖和侵襲能力的影響尚不可知。為了揭示UHRF1在非TNBC和TNBC中的作用，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1臨床資料:收集2018年4月至2020年12月非TNBC女性志愿者30例,年齡28～42歲，平均年齡(35.59±6.09)歲，經(jīng)穿刺活檢病理證實為TNBC的女性患者30例,年齡30～45歲，平均年齡(37.84±8.43)歲，兩組女性的年齡等差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后經(jīng)病理檢查診斷為乳腺癌;②術(shù)前未進(jìn)行過放療或化療;③免疫組化染色ER、PR和HER-2/neu陽性細(xì)胞在10%以下為TNBC有任何一項陽性者定義為非三陰性乳腺癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的患者;②其他腫瘤轉(zhuǎn)移到乳腺的患者;③有嚴(yán)重心、肝、腎功能衰竭的患者;④有嚴(yán)重心血管疾病的患者;⑤有其他系統(tǒng)嚴(yán)重原發(fā)病的患者,如消化道疾病、泌尿系統(tǒng)疾病等。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和UHRF1敲低細(xì)胞系構(gòu)建:人非轉(zhuǎn)化乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞、雌激素和孕激素受體(ER+/PR+)乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7)和TNBC乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231和MDA-MB-436)購自于武漢普諾賽生命科技有限公司。所有細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)的DMEM高糖培養(yǎng)基(Thermo Fisher)中，置于37℃、5% 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。TNBC細(xì)胞系(MDA-MB-231和MDA-MB-436)以MOI=100的比例轉(zhuǎn)導(dǎo)UHRF1-shRNA慢病毒(上海漢恒生物科技有限公司)48h。采用嘌呤霉素篩選獲得陽性的UHRF1敲低(Knock down，UHRF1 KD)細(xì)胞系后擴(kuò)增培養(yǎng)，對數(shù)生長期細(xì)胞接種于12孔板中24h后進(jìn)行相關(guān)實驗。

1.3免疫組織化學(xué)和免疫熒光檢測:乳腺癌組織置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛溶液中48h，依次采用體積分?jǐn)?shù)為75%、80%、95%和100%乙醇梯度脫水60min，二甲苯透明3次，20min/次，浸入熔融石蠟62℃包埋過夜。組織蠟塊4μm厚切片，置于60℃烘箱烘干1h，用Tris/EDTA(pH=8.0)修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，羊血清封閉30min，加入兔抗人UHRF1多克隆抗體(1∶200，武漢三鷹生物)4℃過夜，PBS漂洗3次，每次5min。加入生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶500，北京中杉金橋生物)，室溫孵育30min。PBS漂洗3次，每次5min。隨后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液(北京中杉金橋生物)和DAB顯色液(北京中杉金橋生物)處理，蘇木素復(fù)染。經(jīng)過脫水、透明、封片處理后在顯微鏡下觀察。免疫熒光采用兔抗人UHRF1多克隆抗體(1∶200，武漢三鷹生物)和鼠抗人Ki67多克隆抗體(1∶500，北京博奧森生物)4℃過夜。PBS漂洗3次，每次5min。加入FITC-山羊抗(1∶500，武漢三鷹生物)兔和CoraLite594-山羊抗鼠(1∶250，武漢三鷹生物)二抗。室溫孵育30min。PBS漂洗3次，每次5min。DAPI染色1min，PBS漂洗3次，每次5min。ddH2O漂洗一次，每次5min?？篃晒廨蜏鐒?武漢塞維爾生物)封片，干化過夜后拍照。每張切片隨機(jī)取5個視野，采用Image-Pro Plus6.0軟件計量免疫組化檢測中細(xì)胞的染色面積和強(qiáng)度。免疫熒光計算UHRF1+Ki67+/Ki67+細(xì)胞比例。

1.4qPCR檢測:按照TRizol(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)一步提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA。使用NanoDrop2000對RNA濃度和純度進(jìn)行檢測。參照cDNA合成試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)將500ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取10ng cDNA作模版，SYBGreen I (南京諾唯贊生物科技股份有限公司)為檢測信號，20μL qPCR反應(yīng)體系，反應(yīng)程序：95℃ 3 min，95℃ 5s，60℃ 15 s，擴(kuò)增35個循環(huán)，UHRF1(247bp)引物序列為5'-GGTTTCATCGCCATCCCCA -3'和5'-GTATGGCCGTCCTCCATCTG-3'。ACTB(191bp)引物序列為5'-ACAGAGCCTCGCCTTTGC-3'和5'-CCACCATCACGCCCTGG-3'。采用2-△△Ct計算擴(kuò)增倍數(shù)。

1.5Western blot檢測:將12孔板接種并做相應(yīng)處理后的細(xì)胞用預(yù)泠的PBS潤洗細(xì)胞后，吸干PBS，加入100μL含磷酸化酶抑制劑和Cocktail的RIPA總蛋白裂解液(武漢塞維爾生物科技郵箱公司)，冰上裂解20 min，細(xì)胞刮收集至1.5 mL Ep管，超聲破碎，12,000g 4℃離心20min,取上清液至1.5mL Ep管，以BCA法檢測蛋白濃度，并40g熱變性蛋白上樣，于8%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳，轉(zhuǎn)膜后封閉，加入UHRF1一抗(1∶1000)4℃搖床孵育過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗室溫下作用1h后ECL顯影獲取蛋白條帶。以ImageJ2X分析條帶灰度值，統(tǒng)計分析UHRF1蛋白的表達(dá)量，每組實驗重復(fù)3次。

1.6CCK-8細(xì)胞活力檢測:分別去取對數(shù)生長期的WT和UHRF1 KD MDA-MB-231和MDA-MB-436細(xì)胞。以5，000個細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，0 h、24 h和48 h后加入10μL的CCK-8溶液(Biosharp)并37℃孵育1h，采用酶標(biāo)儀測定 450 nm 的吸光值(OD450)。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.7Ki67細(xì)胞增殖檢測:分別去取對數(shù)生長期的WT和UHRF1 KD MDA-MB-231和MDA-MB-436細(xì)胞。以10000個細(xì)胞/孔接種于24孔培養(yǎng)板中，24 h和48 h后加4%中性甲醛固定液固定15min，PBS漂洗3次，每次5 min。隨后加入0.3% TritonX-100的5% BSA溶液破膜封閉20 min，加入Ki67抗體(1∶200)室溫孵育1 h。PBS漂洗3次，每次5 min。隨后加入DAPI室溫孵育1 min后PBS漂洗3次，每次5 min。ddH2O漂洗一次，每次5 min?？篃晒廨蜏鐒┓馄苫^夜后拍照。每張切片隨機(jī)取5個視野，采用Image-Pro Plus 6.0軟件計量Ki67+細(xì)胞比例。

1.8Transwell侵襲實驗:用50mg/L Matrigel (BD公司)1∶8稀釋液包被Transwell小室(Corning)底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。對數(shù)生長期的WT和UHRF1 KD MDA-MB-231和MDA-MB-436細(xì)胞撤血清饑餓12 h，制備細(xì)胞懸液后以10,000個細(xì)胞200μL加入Transwell小室，下室加入500μL含5% FBS的培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24h后加入0.1%結(jié)晶紫染色染色 15min后拍照。每孔隨機(jī)取5個視野，采用Image-Pro Plus 6.0軟件計量結(jié)晶紫染色比例。

2 結(jié) 果

2.1Non-TNBC和TNBC患者組織中UHRF1的表達(dá):TNBC患者組織中UHRF1蛋白表達(dá)明顯高于Non-TNBC患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，詳見圖1A。且TNBC患者UHRF1+Ki67+/Ki67+細(xì)胞比例明顯高于Non-TNBC，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖1B。

圖1 TNBC患者組織UHRF1和UHRF1+Ki67+/Ki67+細(xì)胞比例明顯高于Non-TNBC。UHRF1在Non-TNBC和TNBC患者組織中表達(dá)比較；B： Non-TNBC和TNBC患者組織中UHRF1+Ki67+/Ki67+細(xì)胞比例比較。(n=16～20)

2.2乳腺癌細(xì)胞系中UHRF1蛋白和mRNA含量比較:TNBC乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231和MDA-MB-436)中UHRF1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于人非轉(zhuǎn)化乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞和雌激素與孕激素受體(ER+ / PR+)乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，詳見圖2。

圖2 人胰腺癌細(xì)胞系高表達(dá)TRPC3。A：UHRF1 mRNA在TNBC乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231和MDA-MB-436)、非轉(zhuǎn)化乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞、雌激素和孕激素受體(ER+ / PR+)乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)比較；B&C：UHRF1 蛋白在TNBC乳腺癌細(xì)胞系(MDA-MB-231和MDA-MB-436)、非轉(zhuǎn)化乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞、雌激素和孕激素受體(ER+ / PR+)乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)比較。(n=3)

2.3下調(diào)UHRF1對TNBC細(xì)胞系增殖的影響:采用UHRF1-shRNA慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)TNBC細(xì)胞系(MDA-MB-231和MDA-MB-436)構(gòu)建UHRF1 KD細(xì)胞系。結(jié)果顯示，UHRF1 KD的TNBC細(xì)胞系(MDA-MB-231和MDA-MB-436)低表達(dá)UHRF1，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，詳見圖3A。與0 h相比，24 h和48 h的UHRF1 WT和UHRF1 KD的TNBC細(xì)胞系(MDA-MB-231和MDA-MB-436)增殖明顯增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，詳見圖3B，C。且相比于UHRF1 WT細(xì)胞，UHRF1 KD的TNBC細(xì)胞系(MDA-MB-231和MDA-MB-436)在48 h的增殖率明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，詳見圖3B，C。同時，UHRF1 KD的TNBC細(xì)胞系(MDA-MB-436)在48 h的Ki67+細(xì)胞比例明顯減少，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，詳見圖3D。

圖3 下調(diào)UHRF1抑制TNBC細(xì)胞系增殖。A&B：UHRF1 WT和UHRF1 KD的TNBC細(xì)胞系(MDA-MB-231和MDA-MB-436)中UHRF1蛋白表達(dá)比較；C&D：UHRF1 WT和UHRF1 KD的TNBC細(xì)胞系(MDA-MB-231和MDA-MB-436)24 h和48 h增值率比較；HRF1 WT和UHRF1 KD的MDA-MB-436的48 h Ki67+細(xì)胞比較。(n=3～6)

2.4下調(diào)UHRF1對TNBC細(xì)胞系侵襲的影響:與WT相比，48 h的UHRF1 KD的TNBC細(xì)胞系(MDA-MB-231和MDA-MB-436)侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯減少，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，詳見圖4。

圖4 下調(diào)UHRF1抑制TNBC細(xì)胞系侵襲。A&B：UHRF1 WT和UHRF1 KD的TNBC細(xì)胞系(MDA-MB-231和MDA-MB-436)侵襲比例比較。(n=3～6)

2.5下調(diào)UHRF1對P53/P21信號的影響:早期研究發(fā)現(xiàn)，UHRF1可通過相關(guān)基因組蛋白和DNA甲基化調(diào)控細(xì)胞增殖和侵襲[9]。主要包括PPAR-γ、BRAC1、P16和FOXO4[8,10,11]。因此，本研究檢測UHRF1靶蛋白的mRNA表達(dá)變化。結(jié)果表明，UHRF1 KD的TNBC細(xì)胞系 (MDA-MB-231和MDA-MB-436)的PPAR-γ、BRAC1、P53和P21 mRNA明顯低于UHRF1 WT細(xì)胞，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖5。

圖5 下調(diào)UHRF1抑制TNBC細(xì)胞系PPAR-γ BRAC1/P53/P21信號。A&B：UHRF1 WT和UHRF1 KD的TNBC細(xì)胞系(MDA-MB-231和MDA-MB-436)P16、BRAC1、FOXO4、PPARG、P53和P21 mRNA表達(dá)比較。(n=3～6)

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，TNBC腫瘤細(xì)胞是一種獨特的高增殖和侵襲性腫瘤細(xì)胞，且其增殖性改變與TNBC患者病情復(fù)雜、惡性度高和預(yù)后不良密切相關(guān)[12]。先前的研究表明，UHRF1在乳腺癌中升高，并且與低UHRF1水平相比，高UHRF1水平的患者預(yù)后較差。且過表達(dá)UHRF1可促進(jìn)MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞增殖和遷移，而其下調(diào)具有相反的功能[13]。UHRF1在增殖細(xì)胞中高表達(dá)，并且不可避免地需要G1/S相變[14]。UHRF1的異常表達(dá)與多種人類惡性腫瘤的侵襲性相關(guān)，而癌細(xì)胞中UHRF1的敲低或沉默導(dǎo)致增殖減少和凋亡增加[12]。因而，探究UHRF1在TNBC腫瘤細(xì)胞的特殊增殖性和侵襲性中作用對解析TNBC的細(xì)胞病理機(jī)制意義重大。

本文研究結(jié)果顯示， TNBC患者乳腺癌組織中UHRF1蛋白表達(dá)明顯高于非TNBC患者，且在具有增殖潛能的細(xì)胞(Ki67+)中，UHRF1水平較高。這表明UHRF1在TNBC患者乳腺癌增殖的調(diào)控至關(guān)重要。同時，通過檢測不同乳腺癌細(xì)胞系的UHRF1蛋白和mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)，TNBC細(xì)胞系高表達(dá)UHRF1。這與早期MDA-MB-231和MDA-MB-438細(xì)胞UHRF1 mRNA高表達(dá)結(jié)果一致[12]。為了進(jìn)一步研究高表達(dá)的UHRF1在TNBC細(xì)胞中的作用。我們建立和使用UHRF1 shRNA 慢病毒構(gòu)建UHRF1 KD的TNBC細(xì)胞系。首先，我們剖析了UHRF1對TNBC細(xì)胞增殖和侵襲的影響。體外實驗表明，下調(diào)UHRF1可抑制TNBC細(xì)胞系(MDA-MB-231和MDA-MB-436)增殖和侵襲。因此， UHRF1可能是逆轉(zhuǎn)TNBC高侵襲轉(zhuǎn)移和惡化的重要分子。據(jù)報道，過表達(dá)的UHRF1參與抑癌基因(包括p16INK4A、BRCA1、RB1、CDH13、SHP1、SOCS3和CDχ2)的表觀遺傳(DNA甲基化和組蛋白修飾)修飾[11,12]。UHRF1抑制癌細(xì)胞凋亡并促進(jìn)腫瘤增殖。同時，UHRF1調(diào)控FOXO4和PPARG基因的甲基化修飾，繼而影響前列腺癌、結(jié)直腸癌和宮頸癌細(xì)胞生長侵襲[10]。本研究證實，下調(diào)UHRF1可抑制TNBC細(xì)胞系中PPAR-γ、BRAC1、P53和P21 mRNA表達(dá)。

綜上所述，UHRF1高表達(dá)與TNBC患者組織，并參與調(diào)控TNBC細(xì)胞增殖和侵襲，其作用機(jī)制與細(xì)胞PPAR-γ BRAC1/P53/P21信號密切相關(guān)。下調(diào)UHRF1可明顯抑制細(xì)胞PPAR-γ BRAC1/P53/P21信號，具有抑制TNBC細(xì)胞增殖和侵襲的作用。然而，UHRF1作為細(xì)胞DNA和組蛋白甲基化的重要調(diào)控分子，其對PPAR-γ BRAC1/P53/P21信號相關(guān)基因甲基化修飾尚需進(jìn)一步的直接證據(jù)。同時，下調(diào)UHRF1是否在體影響TNBC細(xì)胞增殖和侵襲，腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞功能尚需進(jìn)一步闡明。因此其作為TNBC治療靶點仍有待研究。