葛劍，王勇，陳謙學(xué)，王龍

(1.武警湖北總隊(duì)醫(yī)院神經(jīng)外科，武漢 430061；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，武漢 430060)

隨著機(jī)械化的進(jìn)程、生活環(huán)境的變化，人們?cè)絹?lái)越多地暴露于各種應(yīng)激源的刺激中[1]。噪聲被認(rèn)為是當(dāng)今社會(huì)三大公害之一，噪聲應(yīng)激對(duì)人和動(dòng)物的神經(jīng)行為都會(huì)產(chǎn)生不良影響[2-3]。在應(yīng)激源的刺激下，下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸會(huì)對(duì)應(yīng)激進(jìn)行適應(yīng)性調(diào)節(jié)[4]，但人長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)下或應(yīng)激過(guò)于強(qiáng)烈則會(huì)造成學(xué)習(xí)和記憶障礙、抑郁，甚至出現(xiàn)神經(jīng)、免疫功能紊亂[5-6]。葛根素是從豆科植物野葛的干燥根中提取并分離出來(lái)的一種單體，主要成分為4，7-二羥基8-β-D葡萄糖異黃酮，屬異黃酮化合物。研究表明，葛根素對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用，可減少鈣離子內(nèi)流及阻斷β受體，具有非內(nèi)皮依賴性舒血管作用[7-8]，但其對(duì)噪聲刺激下慢性應(yīng)激性大鼠行為學(xué)及腦內(nèi)記憶相關(guān)蛋白的影響筆者尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M生活中人們上下班高峰期暴露于噪聲環(huán)境，于固定時(shí)間段采用交通類型噪聲刺激建立慢性應(yīng)激模型，探討葛根素在噪聲慢性應(yīng)激大鼠行為學(xué)變化中的作用，為后續(xù)研究其潛在的藥理機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)生長(zhǎng)發(fā)育期SD大鼠，體質(zhì)量174～273 g，平均200 g，購(gòu)自湖北省疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2019-0004。受試鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房?jī)?nèi)，12 h/12 h 晝夜循環(huán)照明，室溫(20±3)℃，相對(duì)濕度50%～60%。

1.2藥品與試劑一抗：β-actin[天德悅(北京)生物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)：TDY051，5%脫脂牛奶1：10 000)，瞬時(shí)感受器電位香草酸受體1(transient receptor potential vanilloid subfamily member 1，TRPV1)(Abcam，批號(hào)：ab203103，5%脫脂牛奶1：500)，二抗：HRP-山羊抗兔(ASPEN，批號(hào)：AS1107，5%脫脂牛奶1：10 000)。酶聯(lián)免疫試劑盒蛋白激酶C(protein kinase C，PKC，批號(hào)：120685-11-2，靈敏度10 pg·mL-1)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF，Abcam，批號(hào)：ab108319，靈敏度1.0 pg·mL-1)、磷酸化cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(phosphorylated cAMP-response element binding protein，p-CREB，Santa Cruz，批號(hào)：SC-7978，靈敏度0.1 ng·mL-1)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3儀器與設(shè)備ELx800酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek)，蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad)，凝膠成像及分析系統(tǒng)(英國(guó)Syngene)，顯微鏡BX53(日本Olympus)，Morris 水迷宮軟件(美國(guó)San Diego Instruments，Inc Smart 2.0)，Morris水迷宮為國(guó)產(chǎn)通用大鼠型，圓柱形制桶，直徑150 cm，高50 cm，水深40 cm，平臺(tái)為直徑11 cm×高38 cm的圓形平臺(tái)。

1.4動(dòng)物分組及給藥SD雄性大鼠 32只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組和葛根素小、大劑量組，每組8只。參照文獻(xiàn)[9]，通過(guò)噪聲連續(xù)刺激60 d建立慢性應(yīng)激大鼠模型：葛根素大、小劑量組及模型對(duì)照組置于90 dB噪聲場(chǎng)中，噪聲類型為白、粉噪類交通噪音，每天6 h(上午7：00—9：00，中午11：00—13：00，下午17：00—19：00)規(guī)律性刺激，予以2個(gè)月噪聲刺激，刺激同時(shí)給予正常喂養(yǎng)。正常對(duì)照組未做任何處理。造模結(jié)束后，對(duì)各組大鼠腹腔注射給藥，葛根素小劑量組予以葛根素100 mg·kg-1，大劑量組予以葛根素200 mg·kg-1，均用0.9%氯化鈉溶液配制成2 mL腹腔注射給藥，正常對(duì)照組與模型對(duì)照組用等量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射給藥，每日1次，連續(xù)給藥1周。

1.5測(cè)量指標(biāo)及方法

1.5.1體質(zhì)量變化實(shí)驗(yàn)過(guò)程中測(cè)定每只大鼠造模前及造模后第15，30，45天和給藥后(水迷宮實(shí)驗(yàn)前)的體質(zhì)量變化情況。

1.5.2蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)實(shí)驗(yàn)[10]：在隔噪音、安靜的房間內(nèi)，訓(xùn)練動(dòng)物適應(yīng)含糖飲水，每籠同時(shí)放置2個(gè)水瓶，第1個(gè)24 h，2瓶均裝有1%蔗糖水，隨后24 h，1個(gè)瓶裝1%蔗糖水，1個(gè)瓶裝純水。23 h禁食禁水后進(jìn)行動(dòng)物的基礎(chǔ)蔗糖水/純水消耗實(shí)驗(yàn)，同時(shí)給予每只大鼠事先定量并稱量好的2瓶水：1瓶1%蔗糖水，1瓶純水。1 h 后，取走2瓶并稱定質(zhì)量。計(jì)算動(dòng)物的蔗糖水消耗(%)=蔗糖水消耗/總液體消耗×100%。分別于造模前、造模后第60天、給藥后(水迷宮實(shí)驗(yàn)前)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算蔗糖水消耗。

1.5.3水迷宮實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)時(shí)水溫保持(26±1)℃，室內(nèi)安靜。將大鼠頭朝池壁放入水中，放入位置隨機(jī)取東、西、南、北四個(gè)起始位置之一。記錄大鼠找到水下平臺(tái)的時(shí)間(s)。每只大鼠每天訓(xùn)練4次，兩次訓(xùn)練之間間隔15～20 min，連續(xù)訓(xùn)練5 d。最后一次獲得性訓(xùn)練結(jié)束后的第2天，將平臺(tái)撤除，開(kāi)始60 s的探查訓(xùn)練。將大鼠由原先平臺(tái)象限的對(duì)側(cè)放入水中。記錄大鼠在目標(biāo)象限所花的時(shí)間和進(jìn)入該象限的次數(shù)，以此作為空間記憶的檢測(cè)指標(biāo)。探查訓(xùn)練結(jié)束后的第2天，開(kāi)始維持4 d的對(duì)位訓(xùn)練。將平臺(tái)放在原先平臺(tái)所在象限的對(duì)側(cè)象限，方法與獲得性訓(xùn)練相同。每天訓(xùn)練4次。每次記錄找到平臺(tái)的時(shí)間和游泳距離以及游泳速度。最后一次對(duì)位訓(xùn)練的第2天進(jìn)行，方法與上述探查訓(xùn)練類似。記錄大鼠60 s內(nèi)在目標(biāo)象限(平臺(tái)第2次所在區(qū))所花時(shí)間和進(jìn)入該區(qū)的次數(shù)。水迷宮上方安置攝像機(jī)，用于同步記錄大鼠游泳軌跡，訓(xùn)練期間水迷宮外參照物保持不變。

1.5.4TRPV1、PKC、p-CREB、BDNF蛋白表達(dá)檢測(cè) 免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)鼠腦海馬組織TRPV1蛋白的表達(dá)水平，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)PKC、p-CREB、BDNF蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1葛根素對(duì)噪聲引起的慢性應(yīng)激大鼠體質(zhì)量變化的影響見(jiàn)圖1。各組大鼠在造模前體質(zhì)量相近，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模期間4組大鼠的體質(zhì)量逐漸增加，但與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組和葛根素組大鼠體質(zhì)量增加較緩慢；造模結(jié)束至葛根素給藥第7 天，葛根素大、小劑量組體質(zhì)量均大于模型對(duì)照組(t=3.455，4.230，P<0.01)。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.葛根素小劑量組；D.葛根素大劑量組。

2.2葛根素對(duì)噪聲引起的慢性應(yīng)激大鼠1%蔗糖水?dāng)z入量的影響 見(jiàn)圖2。各組大鼠在造模前1%蔗糖水?dāng)z入量相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。給予噪聲刺激60 d后，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠的糖水?dāng)z入量逐漸下降(P<0.01)，表明模型對(duì)照組大鼠出現(xiàn)快感消失；經(jīng)葛根素處理后，1%蔗糖水?dāng)z入量有一定提高。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.葛根素小劑量組；D.葛根素大劑量組。①與模型對(duì)照組比較，t=7.986，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，t=4.586，P<0.05。

2.3葛根素對(duì)噪聲引起的慢性應(yīng)激大鼠行為學(xué)指標(biāo)的影響見(jiàn)圖3。正常對(duì)照組大鼠游泳路徑較為明確，主要集中在原平臺(tái)所在象限，而模型對(duì)照組大鼠游泳路徑大多出現(xiàn)在非平臺(tái)象限。從圖4可見(jiàn)，撤掉隱藏平臺(tái)后(水迷宮實(shí)驗(yàn)第7 天)，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠在平臺(tái)所在象限所停留的時(shí)間明顯少于非平臺(tái)象限(P<0.05，P<0.01)；經(jīng)小劑量葛根素處理后，所在象限停留的時(shí)間明顯上升(P<0.05)。模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，在目標(biāo)象限游泳總路程明顯下降(P<0.05)。經(jīng)小劑量葛根素處理后，大鼠在目標(biāo)象限游泳總路程有所上升(P<0.05)。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.葛根素小劑量組；D.葛根素大劑量組。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.葛根素小劑量組；D.葛根素大劑量組。①與模型對(duì)照組比較，t=3.269，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，t=2.965，2.926，2.855，P<0.05。

2.4葛根素對(duì)噪聲引起的慢性應(yīng)激大鼠腦內(nèi)記憶相關(guān)蛋白TRPV1、PKC、p-CREB、BDNF表達(dá)的影響 見(jiàn)圖5。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠的腦海馬組織TRPV1蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01)；與模型對(duì)照組比較，葛根素大、小劑量組TRPV1蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01，P<0.05)。4組大鼠的腦海馬組織PKC、p-CREB、BDNF表達(dá)水平的熱圖見(jiàn)圖6，上述3種蛋白中，模型對(duì)照組PKC、p-CREB表達(dá)水平出現(xiàn)顯著變化。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.葛根素小劑量組；D.葛根素大劑量組。①與模型對(duì)照組比較，t=24.050，27.740，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，t=7.623，P<0.05。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.葛根素小劑量組；D.葛根素大劑量組。紫色表示蛋白水平下調(diào)，紅色表示上調(diào)，顏色強(qiáng)度表示蛋白表達(dá)的水平或趨勢(shì)，數(shù)據(jù)表示為樣本的平均值。

3 討論

基于2012—2016年道路交通噪聲監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，全國(guó)道路交通噪聲污染呈不斷惡化趨勢(shì)[11]?！吨袊?guó)環(huán)境噪聲污染防治報(bào)告(2016)》顯示，2015年全國(guó)城市噪聲污染仍較為嚴(yán)峻[12]。研究表明，人們?cè)诟鞣N應(yīng)激源的刺激中，噪聲刺激的影響尤為突出，噪聲的危害除了傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)上的聽(tīng)力損傷，還有其他眾多不良影響[13]。研究顯示，環(huán)境噪音超過(guò)100 dB可影響血壓[14]；人若長(zhǎng)期處在噪聲應(yīng)激狀態(tài)下或應(yīng)激過(guò)于強(qiáng)烈則會(huì)造成空間學(xué)習(xí)和記憶能力障礙[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，噪聲引起的慢性應(yīng)激大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力受到了較顯著影響，而小劑量(100 mg·kg-1)葛根素可部分改善噪聲引起的慢性應(yīng)激大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，葛根素的這一作用可能與腦海馬組織的記憶相關(guān)蛋白TRPV1、PKC、p-CREB、BDNF的表達(dá)水平相關(guān)。

在本研究中，經(jīng)噪音刺激60 d期間，模型對(duì)照組大鼠體質(zhì)量隨噪聲刺激時(shí)間加長(zhǎng)出現(xiàn)增長(zhǎng)緩慢，其糖水消耗量也逐漸降低，表明大鼠對(duì)食物的愉快感隨之降低。模型對(duì)照組在水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，在原有平臺(tái)象限游泳總路程明顯下降，表明噪聲刺激下慢性應(yīng)激大鼠模型制備成功，且該模型大鼠的行為能力明顯下降。給予葛根素腹腔注射后，大鼠體質(zhì)量增加，糖水消耗上升，且其在水迷宮中逃避潛伏期明顯縮短，在原有平臺(tái)象限游泳總路程明顯增加，且小劑量組與模型對(duì)照組之間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明葛根素可以部分改善噪聲刺激下慢性應(yīng)激大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，且小劑量作用效果更顯著，這與余玉玲等[16]發(fā)現(xiàn)小劑量葛根素有效降低D-半乳糖模型大鼠嗅球內(nèi)tau 蛋白磷酸化水平的結(jié)果相一致。

本研究結(jié)果表明，模型對(duì)照組大鼠腦海馬組織的TRPV1、PKC表達(dá)顯著上調(diào)，p-CREB、BDNF表達(dá)顯著下調(diào)，而且葛根素小劑量組TRPV1、PKC表達(dá)顯著下調(diào)，p-CREB、BDNF表達(dá)顯著上調(diào)，提示葛根素改善噪聲刺激下慢性應(yīng)激大鼠的行為學(xué)能力，或與腦海馬組織的記憶相關(guān)蛋白TRPV1、PKC、p-CREB、BDNF的表達(dá)水平相關(guān)。TRPV1作為鈣離子(Ca2+)通道廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)，PKC是G蛋白耦聯(lián)受體的效應(yīng)器，在Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[17]。BDNF和p-CREB是核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的兩種重要的神經(jīng)保護(hù)蛋白，它們的表達(dá)水平可以反映神經(jīng)元抵抗細(xì)胞損傷的能力[18]。上述多功能蛋白可調(diào)節(jié)生化反應(yīng)，并且參與神經(jīng)系統(tǒng)功能的調(diào)控。研究表明，葛根素可減少Ca2+內(nèi)流及阻斷β受體作用于下丘腦-垂體-腎上腺軸[7-8]；此外，WU等[19]證實(shí)葛根素通過(guò)抑制TRPV1、降鈣素基因相關(guān)肽和P物質(zhì)預(yù)防紫杉醇誘導(dǎo)的大鼠周圍神經(jīng)病理性疼痛。以上結(jié)果提示，Ca2+信號(hào)通路可能參與了葛根素的神經(jīng)保護(hù)作用，其分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。