黨裳霓，高潤(rùn)梅，石曉東，張雨晴，李紅月

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西太谷 030801)

穿龍薯蕷(Dioscoreanipponica)屬薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬(Dioscorea)多年生草質(zhì)藤本，廣泛分布于中國(guó)東北、華北、西北(除新疆)及河南、山東、安徽、浙江、江西 (廬山)、陜西 (秦嶺以北)、四川等地[1]。穿龍薯蕷的根狀莖俗稱(chēng)穿山龍，主要活性成分是皂苷類(lèi)化合物，是提取藥用成分薯蕷皂甙的重要原料[2-3]。近年來(lái)隨著對(duì)藥源材料的需求持續(xù)增加，連年的過(guò)度采挖，導(dǎo)致該種的野生資源急劇減少。穿龍薯蕷產(chǎn)地不同，根狀莖的薯蕷皂苷元含量差異較大，品質(zhì)參差不齊[4-5]，因此傳統(tǒng)的繁殖方式存在許多不足。組織培養(yǎng)技術(shù)可滿(mǎn)足大規(guī)模育苗的需要以及加快優(yōu)良品種的推廣[6]。穿龍薯蕷木質(zhì)化程度較高，愈傷組織產(chǎn)生較困難，以營(yíng)養(yǎng)器官(幼根、莖段、葉片)為外植體產(chǎn)生愈傷時(shí)褐化嚴(yán)重，出愈率不高，有些器官根本不產(chǎn)生愈傷組織[7]。根狀莖常年生于地下，表面積累大量外源菌，消毒困難，接種后期還多會(huì)出現(xiàn)內(nèi)源菌污染，造成離體培養(yǎng)失??；而以莖段與葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織會(huì)存在不同程度褐化，嚴(yán)重影響了愈傷組織的生長(zhǎng)。因此，本研究以穿龍薯蕷的種子為試材，分析消毒時(shí)間、培養(yǎng)基激素配比對(duì)愈傷組織、腋芽誘導(dǎo)和生根培養(yǎng)等的影響，以期初步建立穩(wěn)定和高效的穿龍薯蕷離體再生體系。同時(shí)，本研究進(jìn)行了實(shí)生苗和組培苗解剖結(jié)構(gòu)的比較，以期探討穿龍薯蕷在不同培養(yǎng)環(huán)境下的形態(tài)可塑性，衡量該種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力[8-9]，旨在為后期的煉苗移栽及工廠(chǎng)化育苗提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

穿龍薯蕷種子采集于關(guān)帝山龐泉溝自然保護(hù)區(qū)。2018年秋季采集穿龍薯蕷成熟種子，風(fēng)干后冰箱4 ℃冷藏。2019年6月選取飽滿(mǎn)均勻的種子，蒸餾水浸泡3 d后轉(zhuǎn)入200 mg/L的赤霉素溶液中浸泡 24 h，然后用鑷子去掉邊緣的種翅，置于含飽和洗衣粉溶液的燒杯中，流水持續(xù)沖洗30 min，再用蒸餾水沖洗3遍。將供試種子材料，放入超凈工作臺(tái)進(jìn)行消毒[10]。

1.2 外植體消毒

將作為外植體的種子經(jīng)75%酒精表面消毒1 min后，以2% NaClO進(jìn)行消毒處理，分別設(shè)置12、15、18和21 min的處理時(shí)間，期間不斷振蕩；消毒結(jié)束后，用無(wú)菌水沖洗3次后平鋪在不添加激素的MS培養(yǎng)基表面，25 ℃暗培養(yǎng)。比較不同時(shí)間處理的消毒效果，接種15 d后，統(tǒng)計(jì)種子的死亡率、污染率和萌芽率。其中外植體無(wú)污染、未褐變視之為成活。

1.3 外植體離體培養(yǎng)

試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基中均添加蔗糖30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1，pH調(diào)至6.0，121 ℃高壓滅菌30 min。所有培養(yǎng)物均于(25±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1 500 Lx，光、暗時(shí)間各12 h。

1.3.1 愈傷組織誘導(dǎo)愈傷組織選用激素6-BA+NAA(2,4-D)組合來(lái)誘導(dǎo)，采用單因素區(qū)組試驗(yàn)，6-BA濃度為1.0 mg·L-1，NAA、2,4-D各設(shè)置0.2、0.5、1.0 和2.0 mg·L-1等4個(gè)水平，共組成8個(gè)處理組合。每種處理培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，接種30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，出愈率(%)=出愈外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%。

1.3.2 不定芽誘導(dǎo)不定芽的誘導(dǎo)采用激素6-BA與NAA組合來(lái)進(jìn)行，各設(shè)置3個(gè)水平，6-BA分別為1.0、2.0 和3.0 mg·L-1，NAA分別為0.2、1.0 和2.0 mg·L-1，采用雙因素完全區(qū)組試驗(yàn)，共組成9個(gè)配比處理組合。每種處理培養(yǎng)基接種30瓶，進(jìn)行差異顯著性分析。

1.3.3 生根培養(yǎng)苗高3 cm以上時(shí)，進(jìn)行生根誘導(dǎo)以獲得完整再生植株，結(jié)合前人研究結(jié)果，探究生長(zhǎng)素NAA對(duì)生根誘導(dǎo)的影響[6-7,11-12]。以1/2MS為基本培養(yǎng)基添加不同濃度的激素，進(jìn)行生根培養(yǎng)。其中，NAA選取0.1、0.2、0.5和1.0 mg·L-1等4個(gè)濃度水平，6-BA濃度為0.5 mg·L-1，IBA濃度為0.5 mg·L-1，設(shè)置單一NAA處理(0.1、0.5 mg·L-1)及其與6-BA、IBA組合處理(0.5 mg·L-1NAA+ 0.5 mg·L-16-BA；1.0 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA；0.2 mg·L-1NAA + 0.5 mg·L-1IBA)。每種處理培養(yǎng)基接種15瓶，每瓶接種2株，60 d后觀察不同處理的幼苗生長(zhǎng)狀況及生根率、根數(shù)等情況。生根率(%)=生根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%。

1.4 實(shí)生苗和組培苗解剖結(jié)構(gòu)觀察

供試材料為1/2MS+0.5 mg·L-1NAA生根培養(yǎng)基培養(yǎng)60 d的組培苗，選取頂端以下的第3片葉、莖和根狀莖作為試驗(yàn)材料，同時(shí)以室外培養(yǎng)60 d的實(shí)生苗為對(duì)照，比較二者在結(jié)構(gòu)上的差異。其中，葉片剪取中部含主脈0.5 cm×0.5 cm的方塊，放入50% FAA固定液中固定24 h；分別剪取纏繞莖與根狀莖長(zhǎng)0.5 cm的小段，放入70% FAA固定液中固定24 h。固定材料采用常規(guī)石蠟切片，切片厚度12 μm，番紅-固綠對(duì)染，中性樹(shù)膠封片[13]。在NikonEclipse50i光學(xué)顯微鏡下觀察葉片、莖和根狀莖切片解剖結(jié)構(gòu)并拍照，采用Image-ProPlu5.0測(cè)量統(tǒng)計(jì)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理和圖表繪制采用Excel軟件完成。采用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用最小顯著性差異法(Duncan)對(duì)其處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異多重比較，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時(shí)間對(duì)外植體萌發(fā)的影響

由表1可知，2% NaClO消毒時(shí)間對(duì)外植體種子萌發(fā)指標(biāo)(死亡率、污染率和萌芽率)有顯著影響(P<0.05)。其中，隨著消毒時(shí)間的增加，外植體的污染率逐漸降低，消毒15～21 min 處理均顯著低于消毒12 min處理，而其余處理間無(wú)顯著差異；外植體的萌芽率隨消毒時(shí)間延長(zhǎng)而先升后降，并在消毒15 min和18 min分別為63.33%和70.00%，顯著高于其余處理。同時(shí)，隨消毒時(shí)間延長(zhǎng)，外植體死亡現(xiàn)象逐漸加重，成活率顯著下降，死亡率在消毒21 min時(shí)達(dá)43.33%，顯著高于其余處理，而其余處理間則無(wú)顯著差異。可見(jiàn)，采用2% NaClO作為種子消毒劑的消毒時(shí)間以15～18 min為宜，萌芽率高，污染率和死亡率低。

表1 不同消毒時(shí)間對(duì)外植體的處理結(jié)果Table 1 Treatment results of external implants at different disinfection times

2.2 激素NAA、2,4-D濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

待種子發(fā)芽后，接著轉(zhuǎn)至含不同激素種類(lèi)和濃度的培養(yǎng)基中。一周左右胚軸的基部膨大，逐漸有愈傷組織形成，前期出現(xiàn)大量帶芽的愈傷組織。30 d后出愈率調(diào)查結(jié)果(表2)顯示。2,4-D對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)作用明顯優(yōu)于NAA。在1.0 mg·L-16-BA基礎(chǔ)上，同濃度2,4-D的愈傷組織誘導(dǎo)率顯著高于NAA，并且愈傷組織的生長(zhǎng)質(zhì)量差別明顯，具體表現(xiàn)為添加NAA的愈傷組織生長(zhǎng)緩慢，致密較硬(圖版Ⅰ，A)；添加2,4-D的愈傷組織生長(zhǎng)較快，松散柔軟(圖版Ⅰ，B、C)。另外，隨2,4-D濃度升高，外植體出愈數(shù)和出愈率均逐漸增加。其中，在1.0 mg·L-16-BA基礎(chǔ)上，當(dāng)2,4-D濃度為2.0 mg·L-1時(shí)，外植體出愈率最高達(dá)到83.33%?？梢?jiàn)，2,4-D處理的愈傷組織誘導(dǎo)率和生長(zhǎng)質(zhì)量均優(yōu)于NAA，且適當(dāng)提高2,4-D濃度有助于愈傷組織的形成。

表2 不同濃度NAA、2，4-D誘導(dǎo)下外植體種子出愈率Table 2 The seed healing rate of explanst under different concentrations of NAA and 2,4-D

2.3 激素6-BA/NAA配比對(duì)不定芽誘導(dǎo)率的影響

選取誘導(dǎo)獲得的優(yōu)質(zhì)愈傷組織轉(zhuǎn)接到各種誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)1周培養(yǎng)，淡綠色愈傷組織形成很多突起，近而形成多芽體，增殖培養(yǎng)過(guò)程中，不定芽基部有毛狀根產(chǎn)生(圖版Ⅰ，D、E)。9種濃度6-BA/NAA組合處理對(duì)腋芽誘導(dǎo)效果(表3)存在差異，愈傷組織不定芽誘導(dǎo)率存在顯著差異(P<0.05)。其中，培養(yǎng)基中添加2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率最高(90.00%±8.20%)，芽苗長(zhǎng)勢(shì)好，葉色濃綠(圖版Ⅰ，F(xiàn))；激素組合3.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA處理效果次之，誘導(dǎo)率為83.33%±4.71%，芽苗生長(zhǎng)較快，葉黃綠，莖粗壯且長(zhǎng)，出現(xiàn)毛狀根(圖版Ⅰ，G)；激素組合2.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA和3.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-1NAA處理下，不定芽誘導(dǎo)率處于63.33%～73.33%之間；在2.0 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1NAA和1.0 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-1NAA處理下，不定芽的誘導(dǎo)率稍高于50%；其余3種激素組合處理的不定芽誘導(dǎo)率均低于50%。

表3 不同6-BA/NAA配比培養(yǎng)基中不定芽誘導(dǎo)與生長(zhǎng)的情況Table 3 The adventitious bud induction and growth states in the medium with different 6-BA/NAA ratios

2.4 激素濃度及配比對(duì)組培苗生根的影響

將經(jīng)繼代培養(yǎng)后高達(dá)3 cm的小植株，接種于添加不同激素的1/2MS生根培養(yǎng)基上。10 d左右開(kāi)始出現(xiàn)白色根原基，20 d左右組培苗莖段底部逐漸出現(xiàn)白色根，1個(gè)月后小苗生根趨于穩(wěn)定。統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表4)表明，各激素組合處理組培苗的生根數(shù)和生根率差異顯著(P<0.05)。

表4 不同激素及其組合培養(yǎng)基中組培苗生根情況Table 4 The rooting culture status of seedling in medium with different hormones and their combinations

其中，1/2MS生根培養(yǎng)基中單一添加0.5 mg·L-1NAA時(shí)，組培苗平均生根數(shù)為13.2條，生根率為86.70%，顯著高于不添加激素的對(duì)照，也明顯高于其余添加激素處理；培養(yǎng)基在添加0.5 mg·L-1NAA基礎(chǔ)上，再添加0.5 mg·L-16-BA時(shí)，組培苗的平均根數(shù)為10.7條，生根率為73.33%，與添加0.1 mg·L-1NAA處理的接近，但前者組培苗生長(zhǎng)良好，后者組培苗莖較細(xì)弱，葉小黃綠(圖版Ⅰ，K)；培養(yǎng)基添加0.5 mg·L-16-BA，同時(shí)加入1.0 mg·L-1NAA時(shí)，組培苗生根數(shù)大幅下降，與對(duì)照處于相同水平，其生根率也明顯下降，但仍顯著高于對(duì)照；培養(yǎng)基添加0.2 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1IBA時(shí)，組培苗生根數(shù)更少，僅有對(duì)照的45.95%，生根率大幅下降，稍低于對(duì)照(圖版Ⅰ，I)?？梢?jiàn)，組培苗適宜生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg·L-1NAA和1/2MS+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA(圖版Ⅰ，H、J)。

圖版Ⅰ 穿龍薯蕷組織培養(yǎng)中愈傷組織、不定芽、生根及組培苗和實(shí)生苗A.添加NAA形成的愈傷組織；B、C.添加2,4-D形成的愈傷組織；D.愈傷組織誘導(dǎo)出芽；E.毛狀根；F.2.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基；G.3.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1 NAA不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基；H.1/2MS+0.5 mg·L-1 NAA組培苗根部；I.1/2MS+0.2 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1IBA組培苗根部；J.1/2MS+0.5 mg·L-1 NAA生根培養(yǎng)基；K.1/2MS+0.1 mg·L-1 NAA生根培養(yǎng)基；L.實(shí)生苗Plate Ⅰ Callus，adventitious bud，rooting,tissue culture seedling and seedling of Dioscorea nipponicaFig.A.Callus formed by adding NAA;Fig.B，C.Callus formed by adding 2,4-D;Fig.D.Callus induced budding;Fig.E.Hairy root;Fig.F.2.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA adventitious bud induction medium;Fig.G.3.0 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA adventitious bud induction medium;Fig.H.1/2MS+0.5 mg·L-1 NAA the roots of tissue culture seedlings;Fig.I.1/2MS+0.2 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 IBA the roots of tissue culture seedlings;Fig.J.1/2MS+0.5 mg·L-1 NAA rooting medium;Fig.K.1/2MS+0.1 mg·L-1 NAA rooting medium;Fig.L.Seedling

2.5 組培苗和實(shí)生苗營(yíng)養(yǎng)器官解剖結(jié)構(gòu)比較

穿龍薯蕷組培苗的葉片、纏繞莖和根狀莖在解剖結(jié)構(gòu)上與實(shí)生苗存在差異(表5)。首先，葉片厚度、上表皮厚度、主脈維管束面積都表現(xiàn)為實(shí)生苗顯著高于組培苗；柵欄組織厚度二者之間差異不明顯，但組培苗的海綿組織厚度極顯著高于實(shí)生苗，導(dǎo)致二者的柵欄組織厚度/海綿組織厚度(P/S)差異顯著；組培苗葉片主脈維管束面積較小(1 779.81 μm2)，約為實(shí)生苗的1/2(圖版Ⅱ，A、B；表5)。

其次，組培苗和實(shí)生苗在解剖結(jié)構(gòu)的差異以纏繞莖尤為顯著。組培苗纏繞莖的內(nèi)徑、導(dǎo)管面積和維管束數(shù)量均小于實(shí)生苗，但其維管束面積較大，但導(dǎo)管面積/維管束面積較小(0.06)，為實(shí)生苗的1/2(表5)。實(shí)生苗纏繞莖皮層比例小，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)可明顯區(qū)分為厚角組織、厚壁組織與薄壁組織，棱角處厚角組織發(fā)達(dá)(2～3層)，環(huán)狀厚壁組織由2～3層細(xì)胞組成(圖版Ⅱ，C)；組培苗皮層比例大，且無(wú)厚角組織，厚壁組織分化不甚完全，未形成明顯環(huán)帶，多數(shù)為排列疏松的薄壁細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)富含淀粉粒(圖版Ⅱ，D)。實(shí)生苗纏繞莖維管束2輪，均為有限維管束，其中靠近皮層一側(cè)的維管束較小，為外韌維管束，排列疏松；靠近髓部的維管束較大，為雙韌維管束，排列緊密，與外側(cè)的外韌維管束相互間隔排列(圖版Ⅱ，E)；組培苗纏繞莖僅有雙韌維管束，排列極為分散(圖版Ⅱ，F(xiàn))。

表5 組培苗和實(shí)生苗營(yíng)養(yǎng)器官結(jié)構(gòu)比較Table 5 Comparison of vegetative organ structure between tissue culture seedlings and seedlings

另外，根狀莖由周皮、基本組織和散生其中的外韌維管束組成(圖版Ⅱ，G、H)。組培苗和實(shí)生苗根狀莖解剖結(jié)構(gòu)差別不大，維管束數(shù)和維管束面積在實(shí)生苗與組培苗之間差異均不顯著(表5)。

圖版Ⅱ 組培和實(shí)生苗營(yíng)養(yǎng)器官解剖結(jié)構(gòu)比較Xy.木質(zhì)部；Ph.韌皮部；Vb.維管束；Co.厚角組織；Sc.厚壁組織；Pa.薄壁組織；Pc.薄壁細(xì)胞A.實(shí)生苗葉中脈；B.組培苗葉中脈；C.實(shí)生苗纏繞莖表皮；D.組培苗纏繞莖表皮；E.實(shí)生苗纏繞莖；F.組培苗纏莖；G.實(shí)生苗根狀莖橫切；H.組培苗根狀莖橫切Plate Ⅱ Anatomical structure comparison of vegetative organ between tissue culture and live seedlingsXy.Xylem;Ph.Phloem;Vb.Vascular bundle;Co.Collenchyma;Sc.Sclerenchyma;Pa.Parenchyma;Pc.Parenchymal cellFig.A.Midvein of seedling leaf；Fig.B.Midvein of tissue culture seedling leaf；Fig.C.Entangled stem epidermis of seedlings；Fig.D.Entangled stem epidermis of tissue culture seedlings；Fig.E.Seedlings entangled stem；Fig.F.Tissue culture seedlings entangled stem；Fig.G.Seedling rhizome transverse；Fig.H.Rhizome of tissue culture seedlings are transverse

3 討 論

3.1 穿龍薯蕷再生體系建立

愈傷組織誘導(dǎo)是建立植物再生體系或進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化等的重要途徑，在快速繁殖、育種、轉(zhuǎn)基因、脫毒苗生產(chǎn)等方面均有極大的應(yīng)用價(jià)值[14]。彭金環(huán)等[15]對(duì)穿龍薯蕷愈傷組織誘導(dǎo)研究中，以不同外植體為材料誘導(dǎo)愈傷組織，發(fā)現(xiàn)各種營(yíng)養(yǎng)器官均能誘導(dǎo)出愈傷組織，但外植體存在不同程度的褐化，嚴(yán)重影響了愈傷組織的生長(zhǎng)。利用種子誘導(dǎo)出的愈傷組織，生長(zhǎng)速度快，出愈率比較高，而且因?yàn)闆](méi)有機(jī)械損傷，很大程度上抑制了褐化的發(fā)生。但在愈傷組織誘導(dǎo)過(guò)程中，種子須先平鋪于MS培養(yǎng)基中，待種子長(zhǎng)出芽和胚軸再將其接種到誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基中。如若直接接種至愈傷組織培養(yǎng)基中，出愈率很低，2,4-D會(huì)干擾生長(zhǎng)素的分布模式，使整個(gè)胚胎中的生長(zhǎng)素信號(hào)變強(qiáng)，對(duì)植物胚軸形成有抑制作用[16]。培養(yǎng)基中添加的激素類(lèi)型及濃度對(duì)體外繁殖有重要影響。植物激素是影響薯蕷愈傷組織誘導(dǎo)和分化再生植株的重要因素，不同的外植體誘導(dǎo)率和生長(zhǎng)差異很大，植物激素的種類(lèi)和配比濃度也要隨之變化。張數(shù)鑫[17]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)穿龍薯蕷不同外植體的誘導(dǎo)率和生長(zhǎng)差異很大，并以莖尖誘導(dǎo)率最高，莖段次之。

陳鳳清[18]采用無(wú)菌帶芽莖段為外植體，通過(guò)多芽體誘導(dǎo)、微塊莖形成、根誘導(dǎo)和增殖成功建立了再生體系。同時(shí)提出，激素的協(xié)同作用影響芽、根的形成，不同濃度激素適當(dāng)組合對(duì)組織培養(yǎng)更有利。在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是影響離體試管苗生芽和生根的主要決定因素。植物細(xì)胞培養(yǎng)中的器官發(fā)生(類(lèi)型和范圍)取決于生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例[19]。細(xì)胞分裂素，如KT和6-BA，已被證明能促進(jìn)細(xì)胞分裂、芽增殖、芽形態(tài)發(fā)生和抑制根部形成；而生長(zhǎng)素，如NAA和2,4-D通常用于刺激愈傷組織產(chǎn)生和細(xì)胞生長(zhǎng)，啟動(dòng)萌芽和生根，誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生，并刺激莖尖和莖段的生長(zhǎng)[20-23]。本研究以種子為外植體誘導(dǎo)愈傷組織最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-12,4-D，形成愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)好，分化能力強(qiáng)，在6-BA濃度相同的情況下，2,4-D誘導(dǎo)作用優(yōu)于NAA，這與彭金環(huán)研究結(jié)果一致；愈傷組織分化的適宜培養(yǎng)基為MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA，芽苗長(zhǎng)勢(shì)好，葉色濃綠并且在誘導(dǎo)愈傷組織分化芽過(guò)程中產(chǎn)生了毛狀根，后期生根培養(yǎng)中產(chǎn)生的根更加健壯。有研究發(fā)現(xiàn)，毛狀根生長(zhǎng)快，次生代謝產(chǎn)物含量高，遺傳穩(wěn)定，是工業(yè)化生產(chǎn)所向往的，可以實(shí)現(xiàn)藥用植物次生代謝物的工廠(chǎng)化生產(chǎn)[17,24-25]。

3.2 穿龍薯蕷組培苗和實(shí)生苗營(yíng)養(yǎng)器官解剖結(jié)構(gòu)的差異

組培苗生長(zhǎng)的培養(yǎng)瓶中環(huán)境條件與室外差別很大，小苗幼嫩，一直處于可控的環(huán)境下生長(zhǎng)，抗性較低。因此，必須經(jīng)過(guò)煉苗來(lái)提高組培苗對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)性，達(dá)到提高移栽成活率的目的，而煉苗成功與否關(guān)系到整個(gè)組培過(guò)程能否成功完成[26]。本研究通過(guò)比較穿龍薯蕷組培苗和實(shí)生苗葉片、纏繞莖和根狀莖的解剖結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，組培苗葉片形態(tài)、結(jié)構(gòu)變異較大，葉片更薄，柵欄組織和海綿組織分化不完全，P/S值低，其原因可能是組培苗的培養(yǎng)光照較弱，但營(yíng)養(yǎng)和水分充足，幼苗適應(yīng)這樣的生長(zhǎng)條件作出相應(yīng)的形態(tài)與結(jié)構(gòu)調(diào)整[27]。而P/S值常被用作衡量植物抗寒[28]、抗旱[29-30]能力和光合速率高低[31]的重要指標(biāo)，弱光下的組培苗葉片較薄，P/S值隨之降低。因此在煉苗移栽初期要注意環(huán)境的通透性、保水性以及透光性。組培苗的纏繞莖解剖結(jié)構(gòu)也與實(shí)生苗存在顯著差異。很多植物通過(guò)增加莖的表皮厚度來(lái)降低蒸騰作用，減少水分蒸發(fā)，從而抵抗干旱[32-33]。本研究中穿龍薯蕷實(shí)生苗纏繞莖的表皮厚于組培苗，皮層分化出厚角組織與厚壁組織，維管束數(shù)量多，排列較緊密，而組培苗皮層分化簡(jiǎn)單，維管束數(shù)量少，排列分散，可能由于組培苗處于高濕的可控環(huán)境，水分營(yíng)養(yǎng)充足，機(jī)械組織與輸導(dǎo)組織的結(jié)構(gòu)隨之簡(jiǎn)化。

移栽馴化過(guò)程是組培苗組織結(jié)構(gòu)分化發(fā)育日趨完善、逐漸適應(yīng)外界環(huán)境的過(guò)程。也是組培苗由半自養(yǎng)半異養(yǎng)向完全自養(yǎng)轉(zhuǎn)變的過(guò)程[34]。穿龍薯蕷組培苗和實(shí)生苗解剖結(jié)構(gòu)表觀特征的變化是其適應(yīng)不同生態(tài)環(huán)境的具體表現(xiàn)，因此，試管苗在向大田移栽過(guò)程中，要想獲得較高的成活率，使其能夠適應(yīng)外在自然環(huán)境，解剖結(jié)構(gòu)特征發(fā)生相應(yīng)的環(huán)境適應(yīng)性非常重要，在移栽馴化初期應(yīng)重點(diǎn)保障移栽小環(huán)境的濕度與光照，以提高其成活率。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)進(jìn)行了穿龍薯蕷種子組培體系優(yōu)化研究，并在此基礎(chǔ)上開(kāi)展組培苗和實(shí)生苗營(yíng)養(yǎng)器官解剖結(jié)構(gòu)的對(duì)比研究，旨在為后期研究穿龍薯蕷有效藥用成分，以及實(shí)現(xiàn)穿龍薯蕷生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化，促進(jìn)穿龍薯蕷種植產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)支撐。結(jié)果表明：(1)2% NaClO作為種子誘導(dǎo)外植體消毒劑，消毒時(shí)間以15和18 min為佳。(2)MS+1.0 mg·L-16-BA+2.0 mg·L-12,4-D為愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基。(3)MS+2.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA為愈傷組織分化芽的最適培養(yǎng)基。(4)1/2MS+0.5 mg·L-1NAA為最適生根培養(yǎng)基。(5)組培苗和實(shí)生苗解剖結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，組培苗煉苗移栽初期要注意環(huán)境的通透性、保水性以及透光性，使組培苗能夠適應(yīng)外在自然環(huán)境，從而提高其成活率。