張曉敏 郭穎超 劉 衛(wèi)

(華北地質(zhì)勘查局 五一四地質(zhì)大隊(duì)，河北 承德 067000)

前言

硒是人體所必需的微量元素之一，是組成人體谷胱甘肽過氧化酶十分重要的成分，具有延緩衰老，抗癌防癌，提高人體免疫力，拮抗重金屬毒性，清除人體內(nèi)有害自由基等功能，同時(shí)硒是典型的雙功能元素之一，其生理需求量范圍比較窄，日攝入量過低，會(huì)導(dǎo)致硒缺乏癥；日攝入量過高又會(huì)導(dǎo)致硒中毒。中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院經(jīng)過長(zhǎng)期大量的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)一般居民飲食中最低硒供給量為22 μg/d，而最高硒的安全攝入量為400 μg/d。因此，控制硒的攝入量在安全量范圍內(nèi)就顯得十分重要。硒通過食物鏈進(jìn)入人體，硒的存在形式?jīng)Q定其對(duì)人體的作用，其中有機(jī)硒起到有益作用，無機(jī)硒攝入過量會(huì)引起人體中毒。無機(jī)硒又包括亞硒酸鹽Se(Ⅳ)和硒酸鹽Se(Ⅵ)。最近幾年來，隨著人們生活水平的提高和健康保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，富硒農(nóng)作物以及富硒食品越來越受到消費(fèi)者青睞。但是，由于富硒農(nóng)作物以及富硒食品的加工、生產(chǎn)方式不同，農(nóng)作物以及富硒食品中硒的存在形態(tài)也有很大差異，特別要關(guān)注的是一些商家直接將無機(jī)硒加入農(nóng)產(chǎn)品中，可能對(duì)消費(fèi)者健康產(chǎn)生極大的危害。因此，十分有必要對(duì)農(nóng)作物中硒的價(jià)態(tài)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)著重研究農(nóng)作物中無機(jī)硒包括Se(Ⅳ)和 Se(Ⅵ)含量的測(cè)定[1-6]。

目前，測(cè)定農(nóng)作物中無機(jī)硒的方法有氣相色譜(GC)法，液相色譜(LC)法，毛細(xì)管電泳(CE)法，高效液相色譜-原子熒光光譜(HPLC-AFS)法以及高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)法。本文采用高效液相色譜-原子熒光光譜法測(cè)定農(nóng)作物中的無機(jī)硒含量。該方法具有操作相對(duì)簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本較低、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、精密度高的特點(diǎn)，適宜推廣應(yīng)用[7-10]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器設(shè)備

AFS 8500高效液相色譜-原子熒光儀(北京海光儀器有限公司)，自動(dòng)進(jìn)樣器(北京海光儀器有限公司)，語路KQ-100 超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，L580離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，BSA124S電子天平(北京賽多利斯電子天平有限公司)，XH-C快速混勻器(常州楚新儀器制造有限公司)，Athena C18-WP 保護(hù)柱(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)，Athena C18-WP液相色譜柱(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試劑與材料

實(shí)驗(yàn)所用水為去離子水，磷酸二氫鉀、磷酸氫二銨、硫酸銅、四丁基溴化銨、碘化鉀、氫氧化鉀、硼氫化鉀、甲酸均為分析純，甲醇為色譜純。

浸提劑：磷酸二氫鉀溶液(0.1 mol/L)+硫酸銅溶液(1.56 mol/L)；

流動(dòng)相：甲醇(5%)+磷酸氫二銨(25 mmol/L)+四丁基溴化銨溶液(0.5 mmol/L)，需要用0.45 μm濾膜過濾后，調(diào)節(jié)pH值，超聲脫氣后使用。

氧化劑：碘化鉀(1%)+氫氧化鉀溶液(0.5%)，現(xiàn)用現(xiàn)配。

還原劑：硼氫化鉀(2%)+氫氧化鉀溶液(0.5%)，現(xiàn)用現(xiàn)配。

載流：鹽酸溶液(10%)，現(xiàn)用現(xiàn)配。

亞硒酸根標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液Se(Ⅳ，1 000 μg/mL，GFGG-060034-08-01，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)，硒酸根標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液Se(Ⅵ，1 000 μg/mL，GFGG-060034-09-01，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。

Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.00 μg/mL)：分別移取100 μL Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液分別于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。

分別取Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、5、10、20、50、100 μL轉(zhuǎn)入1 mL進(jìn)樣瓶中，分別加入1 000、999、995、990、980、950、900 μL流動(dòng)相混勻后，待測(cè)。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取農(nóng)作物樣品2.0 g(精確至0.000 1 g，固體粉末)于10 mL離心管中，加入10 mL浸提液，充分浸取混勻后，于70 ℃超聲清潔儀里超聲30 min，4 500 r/min離心機(jī)上離心10 min，用0.45 μm濾膜過濾后收集于自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。

1.4 儀器工作條件

AFS 8500原子熒光光譜-高效液相色譜儀工作參數(shù)，見表1。

表1 AFS 8500原子熒光光譜儀-高效液相色譜工作參數(shù)Table 1 AFS 8500 atmic fluoresence spectrum high-performance liquid chromatography working parameters

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相pH值對(duì)保留時(shí)間的影響

流動(dòng)相pH值是影響保留時(shí)間的一個(gè)非常重要的因素，pH值變化，使得流動(dòng)相的極性發(fā)生變化，因此，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的保留時(shí)間也會(huì)隨著發(fā)生變化?？疾炝瞬煌琾H值對(duì)農(nóng)作物中Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)保留時(shí)間的影響，見圖1。

圖1 流動(dòng)相pH值對(duì)保留時(shí)間的影響Figure 1 Effect of mobile phase pH on retention time.

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著流動(dòng)相pH值的增大，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的保留時(shí)間也隨之增加。因此實(shí)驗(yàn)選擇最佳的pH值為6.0。

2.2 流動(dòng)相甲醇濃度對(duì)保留時(shí)間的影響

對(duì)于C18柱，增加流動(dòng)相中甲醇的濃度，保留時(shí)間也會(huì)隨之發(fā)生變化，考察了不同流動(dòng)相濃度下對(duì)保留時(shí)間的影響，如圖2所示。

圖2 流動(dòng)相甲醇濃度對(duì)保留時(shí)間的影響Figure 2 Effect of mobile phase methanol concentration on retention time.

從圖2可以看出，隨著流動(dòng)相甲醇濃度的不斷增大，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的保留時(shí)間逐漸縮短，選擇流動(dòng)相甲醇濃度5%作為最佳的實(shí)驗(yàn)條件。

2.3 超聲時(shí)間對(duì)浸出率的影響

超聲時(shí)間不同，會(huì)影響農(nóng)作物中Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ) 的浸提效率，考察了隨著超聲時(shí)間的變化，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的回收率情況，如圖3所示。

由圖3可以看出，隨著超聲時(shí)間的增加，農(nóng)作物中Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的回收率逐漸增大，當(dāng)達(dá)到30 min 后，不隨著超聲時(shí)間的增長(zhǎng)發(fā)生變化，因此，選擇超聲時(shí)間30 min為最佳超聲時(shí)間。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)回收率的影響Figure 3 Effect of ultrasonic time on recovery of Se(IV)and Se(VI).

2.4 載流對(duì)保留時(shí)間的影響

載流HCl的濃度對(duì)Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的保留時(shí)間有一定影響，考察了不同的載流HCl濃度對(duì)農(nóng)作物中Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)保留時(shí)間的影響。

通過圖4實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)載流HCl的濃度對(duì)Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的保留時(shí)間有一定的影響，隨著載流HCl濃度的增加，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的保留時(shí)間逐漸減小，當(dāng)載流HCl的濃度為10%以上后，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的保留時(shí)間不再有明顯變化。因此，選擇載流HCl的濃度為10%作為最佳。

圖4 載流HCl濃度對(duì)Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的保留時(shí)間的影響Figure 4 Effect of current-carrying HCl concentration on the retention time of Se(IV)and Se(VI).

2.5 最佳條件下Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)分離效果

在流動(dòng)相pH值為6.0、流動(dòng)相甲醇濃度為5%、樣品超聲時(shí)間為30 min、載流HCl的濃度為10%條件下，Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)分離效果見圖5。

圖5 最佳條件下Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)分離效果圖Figure 5 Separation of Se(IV)and Se(VI) under optimal conditions.

從圖5 中農(nóng)作物Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)分離效果可以看出，本方法中Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的保留時(shí)間分別為2.60 min和3.80 min，大大提高了生產(chǎn)效率，節(jié)約了生產(chǎn)成本。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和檢出限

按照方法所述實(shí)驗(yàn)條件對(duì)Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定，并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明：Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)的濃度在0～100 μg/L范圍內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積呈一定的線性關(guān)系，線性回歸方程、標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 線性回歸方程、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Correlation coefficient and detection limit of linear equation and standard curve

2.7 方法精密度與加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

按實(shí)驗(yàn)方法對(duì)已知本底值的樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，計(jì)算加標(biāo)回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表3。

表3 精密度和回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of precision and recovery tests(n=7)

通過對(duì)已知本底值的樣品進(jìn)行精密度(n=7)實(shí)驗(yàn)和加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)回收率在91.5%～96.3%，RSD在 5.8%～8.2%。

3 結(jié)論

采用高效液相色譜-原子熒光光譜法對(duì)農(nóng)作物中的Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)進(jìn)行測(cè)定，具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低、分析數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，精密度高，回收率好的特點(diǎn)，適用于農(nóng)作物中無機(jī)硒的大批量樣品測(cè)試。