劉浩，穆蘭，黃志偉，楊瑞明，宮亮

(錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

喉鱗狀細胞癌(laryngal squamous cell carcinoma,LSCC)是頭頸部第二大常見的惡性腫瘤，僅次于鼻咽癌，病因至今仍不十分明了，其發(fā)生可能與吸煙、飲酒、病毒感染、放射線、性激素等因素有關。目前LSCC的治療方式主要是手術切除腫瘤結合放療和化療[1]。盡管治療技術有所提高，但LSCC的生存率并沒有顯著提高[2]。因此迫切需要尋找新的喉癌靶向治療，以延長患者的生命并提高患者的生存質量。

第二代測序技術又稱下一代測序技術(next generation sequencing,NGS),是近年來新興的一項比較成熟的轉錄組學測序技術，可同時對數以百萬的基因進行序列測序并篩選差異表達的基因。miRNA是一類大小為19～25個核苷酸組成的非編碼小RNA分子，通過結合mRNA的3'端，導致mRNA沉默或降解影響其表達水平。研究表明miRNA的異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。大量研究表明[3-4]，miRNA在喉癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調控作用。本研究通過第二代測序技術與生物信息學方法的結合，并通過qRT-PCR在臨床樣本上去驗證去篩選差異表達的miRNA，并期望對喉癌的臨床診斷、治療及預后提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 材料

研究樣本：臨床收集2019年1月至2020年10月就診于錦州醫(yī)科大學并接受手術治療的33例患者的喉癌組織及癌旁組織(>0.5 cm)，所有患者在行手術前均未接受過放療和化療等治療方式。所有標本切除后取部分喉癌及癌旁組織(與腫瘤安全界>0.5 cm)，迅速放入液氮中并轉-80 ℃冰箱保存。病理采集過程及后續(xù)實驗均得到知情者同意以及醫(yī)學倫理委員會批準,且為患者簽署保密協議。

主要試劑：TRIzol試劑、反轉錄試劑盒(Invitrogen，美國)；miRNeasy Mini Kit(總RNA抽提試劑盒，Qiagen，德國)；RNA Nano 6000檢測試劑盒、SYBRGreenPCR試劑盒(羅氏公司)；文庫制備試劑盒(Illumin，美國) ；miR-106a-5p引物購自北京擎科生物科技有限公司。儀器：分光光度儀(NanoPhotometer，美國)；核酸樣品分析儀(Agilent Bioanalyzer2100，美國)；第二代DNA測序系統(tǒng)(Illumina Hiseq4000，美國)；實時定量PCR檢測儀(Roche Light CyclerTM480，瑞士)。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及質量鑒定

取喉癌及癌旁組織樣本各20 mg,按照TRIzol和miRNeasy Mini Kit試劑盒提供的說明書要求提取總RNA，應用NanoPhotometer分光光度儀對提取的總RNA進行純度及濃度檢測，使用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)的RNA Nano 6000檢測試劑盒評估RNA完整性、質量及分布。

1.2.2 miRNA測序文庫的制備與測序

隨機抽取3例患者的喉癌組織及癌旁組織的總RNA進行cDNA文庫的建立和測序。每個樣本總RNA量為3 μg用于下一代測序實驗，采用Illumina的NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set制備cDNA文庫。將獲得的小RNA文庫在生物分析儀(Agilent，High Sensitivity DNA Kit)上進行定量，合并，并使用3%凝膠BluePippin HT (Sage Science)提取適當范圍的cDNA片段(140～160 bp)。文庫最終長度范圍在安捷倫Bioanalyzer 2100 (Agilent)上用高靈敏度DNA試劑盒進行驗證，僅包含部分微小RNA。最后用第二代DNA測序系統(tǒng)(Illumina Hiseq4000)對構建獲得的cDNA文庫進行測序，獲取的信息通過計算機進行分析，并對微小RNA序列進行解碼和注釋[5]。

1.2.3 差異miRNA的生物信息學分析

首先使用Cutadapt軟件修剪并去除質量評分較低的堿基序列和測序得到的序列3′和5′接頭，并去除短17 bp的修剪序列。然后對剩余序列質量進行驗證(FastQC軟件),進而初步完成對數據的篩選。 然后用miRDeep2 v2.0.0.7軟件的quantifier.pl模塊[6]和SeqBuster軟件的miraligner[7]使用默認參數，以前體和成熟miRNA序列作為參考，對過濾后的reads進行miRNA和isomiRNA定量 (miRBase v21)。利用“DESeq2”R中實現的負二項廣義線性模型，對3組喉癌和癌旁樣本中的miRNA進行差異表達的分析，以P<0.05且log2(fold change,FC)>1判定為表達具有顯著差異性。通過繪制火山圖展現喉癌組織中有顯著性差異表達的miRNA,以紅點表示喉癌組織中表達顯著上調，綠點表示表達顯著下降；取差異表達明顯的miRNA,通過繪制聚類分析熱圖，展現miRNA在不同組織樣本中的表達情況，紅色代表高表達，藍色代表低表達。通過繪制維恩圖，展現篩選出的miRNA在喉癌與癌旁組織的分布情況。

1.2.4 qRT-PCR

隨機挑取1種差異表達明顯的miRNA(miR-106a-5p)，采用qRT-PCR檢測miR-106a-5p在30例喉癌及癌旁組織中的表達水平，并對比二代測序結果。 將30組提取好的總RNA，按逆轉錄試劑盒合成cDNA，然后進行qRT-PCR，反應條件為：95 ℃ 60 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 15 s(40個循環(huán))。本反應以U6 snRNA為內參基因，應用7500 System SDSSoftware軟件，統(tǒng)計ΔΔCt值，并以2-ΔΔCt值代表miR-106a-5p的表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 RNA抽提結果

經NanoPhotometer分光光度儀檢測結果顯示，喉癌及癌旁組織中抽提獲得的RNA的D260 nm/D280 nm值均為1.8～2.1，說明提取的總RNA有較好的純度。經過Agilent Bioanalyzer 2100檢測結果顯示，RNA的RIN值≥6，數據表明提取的總RNA具有較好的完整性。樣本提取的RNA總量≥3 μg，具備二代測序的要求。

2.2 差異表達miRNA的可視化分析

本次測序共檢測到1624種miRNA，其中差異表達明顯miRNA的共44種，其中23種在喉癌組織中顯著下調，21種在喉癌組織中顯著上調。miRNA的差異表達見火山圖1，聚類分析熱圖見圖2，miRNA在喉癌及癌旁的分布情況見維恩圖3。

綠點表示顯著下調，紅點表示顯著上調，藍點表示無明顯差異

紅框代表高表達，藍框代表低表達，Tumor代表喉癌組，Normol代表癌旁組

差異miRNA分布情況，VPT代表喉癌組，VPN代表癌旁組

2.3 qRT-PCR結果及驗證

在46種差異表達明顯的miRNA中隨機抽取1種(miR-106a-5p),其二代測序結果顯示在喉癌組織中表達上調，見表2。qRT-PCR檢測結果，miR-106a-5p在30例喉癌組織中的表達水平為(5.71±1.65)，癌旁組織中的表達水平為(2.66±0.87)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與二代測序結果一致，見圖4。

圖4 miR-106a-5p在30組喉癌及癌旁組織的表達水平

表2 癌組織及癌旁組織中miR-106a-5p表達水平

3 討 論

第二代測序技術為分析miRNA的生物學信息研究提供了新的思路，它可同時分析miRNA的表達水平和序列變化[8]。與其他需要使用預先設計的探針的微陣列或qRT-PCR方法不同，第二代測序技術可以識別分析樣本中存在的所有miRNA分子，而不受新的miRNA和新序列亞型[9]的影響。miRNA是一種短鏈非編碼小RNA，通過與轉錄本[10]中的互補序列結合抑制蛋白編碼基因的表達。雖然關于miRNA的所有生物學功能尚未明確，但已有研究表明，miRNA可以調控至少一半的人類蛋白編碼基因的表達，包括致癌基因和抑癌基因[11-12]。因此，應用第二代測序技術去研究發(fā)掘差異性表達的miRNA，并為臨床治療提供有價值的生物靶點具有重要的臨床意義。

本研究通過第二代測序技術與生物信息學方法的結合方法，從3組喉癌及癌旁組織中共篩選出1624種miRNA，其中差異表達明顯的miRNA共有44種，23種在喉癌組織中表達顯著下調，21種在喉癌組織中表達顯著上調。經過qRT-PCR驗證表明，miR-106a-5p在30組喉癌組織的表達水平明顯高于癌旁組織，與二代測序結果一致。雖然此次測序成功篩選的miRNA并不多，而且顯著差異性表達的miRNA占比比較少，但是它們潛在的臨床價值是非常巨大的。譬如我們經過qRT-PCR驗證并篩選的miR-106a-5p已經在相關腫瘤性疾病中進行了大量的研究。研究表明,miR-106a-5p在肺癌[13]、卵巢癌[14]中高度表達，并促進癌癥細胞的增殖及遷移，然而在腎癌[15]中表達下調，并通過調控VEGFA抑制癌癥細胞的增殖及遷移。然而關于miR-106a-5p與喉癌的相關性分析尚不明確，有待于進一步實驗去研究。

喉鱗狀細胞癌的發(fā)生與發(fā)展是復雜而多變的病理過程。而miRNA在機體的生長、細胞凋亡、分化、代謝和腫瘤性疾病的發(fā)生發(fā)展中均展現了強大的調控能力。因此提高miRNA與喉癌之間的發(fā)病機制的認知尤為重要。本次實驗二代測序及qRT-PCR驗證的樣本相對較少，且篩選出差異性表達明顯的miRNA并不多，將來可以投入更大量的樣本中去篩選、驗證有價值的miRNA。

綜上所述，應用二代測序技術去篩選疾病相關miRNA是一條高效率且快捷的途徑，為探索喉癌的分子機制提供了重要思路，也為臨床尋找新的生物靶點奠定了基礎。