金宏凱，劉星，高峰，藺廣榮

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000；3.濱州市人民醫(yī)院普外科，山東 濱州 256610)

隨著人類(lèi)生活水平的提高及生活方式的改變，肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)發(fā)病率呈每年遞增的趨勢(shì)，成為最致命的癌癥之一[1]。90%以上為肝細(xì)胞癌，其主要病因與乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)有關(guān)[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，HBV攜帶者發(fā)生HCC的相對(duì)危險(xiǎn)性是非攜帶者的10倍。由于其惡性程度高，起病隱匿，發(fā)覺(jué)時(shí)已處于中晚期，失去最佳手術(shù)時(shí)機(jī)[3]。因此探討其發(fā)病機(jī)制具有重大意義。

雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種高度進(jìn)化的保守的蘇氨酸/絲氨酸激酶，在細(xì)胞內(nèi)外生長(zhǎng)信號(hào)和細(xì)胞代謝整合中發(fā)揮重要的作用[3]581-585。HBx基因是HBV基因組中最小的開(kāi)放性讀碼框，包含四段重疊的開(kāi)放閱讀框，分別編碼病毒折疊、核心蛋白、病毒聚合酶和調(diào)節(jié)性x蛋白(HBx)，其中HBx蛋白在調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞增殖、發(fā)展及凋亡發(fā)揮重要作用。目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)較少報(bào)道m(xù)TOR、HBx蛋白在乙肝相關(guān)性肝癌聯(lián)合表達(dá)研究。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)在乙肝相關(guān)性肝癌中的mTOR和HBx兩項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)情況，并探討臨床病理參數(shù)及預(yù)后與其表達(dá)的相互關(guān)系，提供一種關(guān)于乙肝相關(guān)性肝癌治療靶點(diǎn)的新思路，也希望為臨床上乙肝相關(guān)性肝癌的預(yù)后隨訪提供有意義的參考數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2010年1月至2015年5月于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院行手術(shù)切除并由兩位高年資病理學(xué)家雙盲法觀察、確診無(wú)誤的肝癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織(距離癌灶>3 cm)標(biāo)本共69例。所有患者臨床及隨訪資料完整，術(shù)前均未行放化療及其它抗腫瘤治療。所有患者均具有明確的HBV 病毒感染病史或 HBV-DNA 檢測(cè)陽(yáng)性。69例肝癌患者中，男性40例，女性29例；年齡41～76歲，平均(54.8±12.3)歲；腫瘤直徑≤5 cm 30例，>5 cm 39例；腫瘤數(shù)目單發(fā)26例，多發(fā)43例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ期42例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例；低分化38例，高中分化31例；甲胎蛋白(AFP)水平≤200 ng/mL 35例，>200 ng/mL 34例；獲得術(shù)后3～50個(gè)月隨訪者61例，失訪8例。參照2010年美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)分期方法進(jìn)行臨床分期。本研究通過(guò)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)審批，所有患者均已簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

一抗mTOR購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司；一抗HBx購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；即用型SABC免疫組化染色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；DAB顯色劑購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 免疫組化染色

免疫組織化學(xué)技術(shù)采用SABC法，一抗均按1∶200稀釋，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。組織標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋等實(shí)驗(yàn)步驟處理，以4 μm厚度進(jìn)行連續(xù)切片，微波修復(fù)，3%雙氧水封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，之后進(jìn)行血清封閉。依次加入一抗、二抗及Strept Avidin-Biotin Complex，隨后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，最后采用中性樹(shù)膠封片。陰性對(duì)照為取代一抗的PBS。

結(jié)果判定：以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色、黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。本次實(shí)驗(yàn)染色結(jié)果由兩位經(jīng)驗(yàn)病理科醫(yī)生雙盲法獨(dú)立閱片。使用了半定量計(jì)分法，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)：隨機(jī)選取5個(gè)200×的高倍鏡視野，根據(jù)每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞的百分率進(jìn)行計(jì)數(shù)，小于5%記為0分，5%～25%(包括5%)記為1分，25%～50%(包括25%)記為2分，大于50%(包括50%)記為3分。著色強(qiáng)度分類(lèi)按照：褐或棕褐色記為3分，黃或棕黃色記為2分，淡黃色記為1分，無(wú)著色記為0分。兩者記分相乘大于等于4分記為免疫組化陽(yáng)性(+)，小于4分記為免疫組化陰性(-)。

1.4 隨訪

術(shù)后對(duì)患者每3個(gè)月進(jìn)行1次定期隨訪，主要以門(mén)診復(fù)查或電話隨訪形式進(jìn)行。隨訪截止時(shí)間為2018年9月30日。隨訪的主要內(nèi)容包括患者一般臨床資料及生存狀態(tài)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

運(yùn)用 SPSS 22.0軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以百分比(%)作為表示，比較用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析運(yùn)用Spearman進(jìn)行分析，選擇Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較用Log-rank檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 mTOR、HBx在癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

mTOR、HBx主要定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，鏡下看到黃色或者棕褐色顆粒，癌旁組織不表達(dá)或局灶呈弱表達(dá)，見(jiàn)圖1、圖2。mTOR、HBx在癌組織(57.97%，66.67%)的表達(dá)均高于癌旁組織(11.59%，17.39%)，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2分別為32.711、34.381，均P<0.001)。

圖1 mTOR、HBx在癌組織中的表達(dá)(SABC,200×)

圖2 mTOR、HBx在癌旁組織中的表達(dá)(SABC,200×)

2.2 mTOR、HBx蛋白表達(dá)與乙肝相關(guān)性肝癌臨床病理特征的關(guān)系

癌組織中mTOR、HBx蛋白的表達(dá)均與TNM分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、性別、腫瘤大小、數(shù)目及AFP水平無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 mTOR、HBx蛋白表達(dá)與乙肝相關(guān)性肝癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 乙肝相關(guān)性肝癌組織中mTOR、HBx蛋白表達(dá)相關(guān)性

Spearman分析顯示癌組織中mTOR、HBx蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.644，P=0.000)，見(jiàn)表2。

表2 乙肝相關(guān)性肝癌組織中mTOR、HBx蛋白表達(dá)相關(guān)性

2.4 mTOR、HBx蛋白的表達(dá)與乙肝相關(guān)性肝癌患者預(yù)后之間的關(guān)系

在已獲得隨訪資料的61例患者中，mTOR和HBx共高表達(dá)37例，低表達(dá)20例。通過(guò)用Kaplan-Meier繪制生存分析曲線，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)組中位生存時(shí)間為13個(gè)月，95%置信區(qū)間為10.754～15.246；低表達(dá)組為27個(gè)月，95%置信區(qū)間為22.671～31.329，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)分析比較兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.031)，見(jiàn)圖3。

圖3 mTOR、HBx在癌組織中總生存率分析

3 討 論

自噬是溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)代謝分解的過(guò)程，其調(diào)節(jié)受多因素影響[4]。目前已發(fā)現(xiàn)40多種自噬相關(guān)蛋白參與腫瘤細(xì)胞的自噬通路。其中mTOR發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能。mTOR基因定位1p36.2，由2549個(gè)氨基酸編碼而成蛋白，分子量為280 KDa，是PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。在生物體內(nèi)以mTORC1和mTORC2兩種形式存在，通過(guò)逐級(jí)磷酸化下游蛋白來(lái)加速細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡及提高腫瘤的活性[5]。mTORC1上游調(diào)控因子主要為胰島素、氧氣、生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)狀況及GMP/GTP等[6]。本質(zhì)是整合信號(hào)通路的中央細(xì)胞激酶，調(diào)節(jié)合成和分解代謝過(guò)程。mTORC2能磷酸化血清/糖皮質(zhì)激素激酶(SGK)家族成員，而SGK3的激活與腫瘤有關(guān)，能夠通過(guò)INPP4B增強(qiáng)PI3K信號(hào)[7]。目前已證實(shí)mTOR在胃癌[8]、乳腺癌[9]及肺癌[10]等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)。林凱煌等學(xué)者采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度的mTOR抑制劑AZD2014(10、100、500、1000 nmol/L)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的作用，結(jié)果顯示10、100、500、1000 nmol/L的AZD2014均可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力，抑制程度與其濃度呈正相關(guān)(P<0.05)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，mTOR在乙肝相關(guān)性肝癌組織中表達(dá)率高于癌旁組織，經(jīng)χ2檢驗(yàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢?jiàn)mTOR參與了乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)生。本研究通過(guò)分析mTOR與乙肝相關(guān)性肝癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)mTOR表達(dá)與分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可見(jiàn)mTOR參與了乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)展。

HBx蛋白是一種能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、影響多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、促進(jìn)細(xì)胞增殖及干擾DNA修復(fù)等多功能的調(diào)節(jié)蛋白[12]，該蛋白是一個(gè)能夠引發(fā)肝癌的潛在機(jī)制，涉及到其在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。病理組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，HBx蛋白在機(jī)體受到HBV感染的不同階段會(huì)出現(xiàn)不同的分布特征。在原發(fā)性肝細(xì)胞癌病例中能夠檢測(cè)到強(qiáng)烈彌散的核內(nèi)反應(yīng)，在急性或慢性的乙型肝炎病例中，則會(huì)出現(xiàn)局灶的胞漿和核內(nèi)分布[13]。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證實(shí)在培養(yǎng)細(xì)胞的胞質(zhì)和核內(nèi)都能檢測(cè)到HBX蛋白的相關(guān)表達(dá)，在核內(nèi)的表達(dá)強(qiáng)度較弱，并發(fā)現(xiàn)HBX在胞質(zhì)內(nèi)能夠激活信號(hào)傳導(dǎo)通路，在核內(nèi)能夠反式激活轉(zhuǎn)錄成分[14]。而本研究發(fā)現(xiàn)，HBx主要定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。范麗等[15]研究發(fā)現(xiàn)，HBx能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2株中增殖、侵襲及血管新生分子的表達(dá)。本研究用免疫組織化學(xué)方法證實(shí)HBx蛋白在乙肝相關(guān)性肝癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究還發(fā)現(xiàn)HBx蛋白與分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)?？梢?jiàn)HBx蛋白與乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)生發(fā)展密切有關(guān)，這一點(diǎn)與既往研究一致[16]。而對(duì)于HBx蛋白在肝癌中的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，HBx可通過(guò)反式激活作用促進(jìn)白細(xì)胞介素18(IL-18)的表達(dá)，以Fas/FasL通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。體外實(shí)驗(yàn)表明，HBx還能通過(guò)激活Wnt/β-catenin、NF-κB、TGF-β等細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中參與肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，mTOR和HBx經(jīng)Spearman分析，兩者表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.644，P=0.000)?，F(xiàn)推測(cè)HBx可能通過(guò)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路參與了肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移。既往研究表明，Hippo信號(hào)通路可以介導(dǎo)PTEN通過(guò)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞增殖和成瘤[19]。而王慶亮研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)mTOR表達(dá)能提高人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的熱療敏感性,其作用機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及S期生長(zhǎng)阻滯有關(guān)[20]。可見(jiàn)mTOR通過(guò)不同的信號(hào)途徑參與了肝癌的侵襲與發(fā)展。隨訪結(jié)果顯示，mTOR、HBx蛋白高表達(dá)組中位生存時(shí)間為13個(gè)月，低表達(dá)組中位生存時(shí)間為27個(gè)月，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)分析比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031)。可見(jiàn)mTOR和HBx還與預(yù)后密切相關(guān)。

綜上所述，我們可以發(fā)現(xiàn)mTOR、HBx蛋白相互作用共同參與了乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)生與發(fā)展，且與患者預(yù)后有關(guān)，為肝癌的治療提供了新的靶點(diǎn)。但其具體機(jī)制尚待今后細(xì)胞學(xué)及動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究證實(shí)。