胥智銘，高宇，吳超

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000；3.撫順市中心醫(yī)院，遼寧 撫順 113000)

高血壓是心血管疾病最主要危險(xiǎn)因素，其發(fā)病率逐年升高且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)，已成為全球不可輕視的重大公共衛(wèi)生問題[1-2]。非洛地平(felodipine,FDP)是一種二氫吡啶類鈣離子通道拮抗劑，其降壓作用平穩(wěn)，對(duì)各期高血壓療效明顯，不良反應(yīng)少，目前在臨床上被重點(diǎn)關(guān)注。但非洛地平屬于BCSⅡ類藥物，即水溶性差，滲透性高?？诜锹宓仄诫y以被機(jī)體吸收，生物利用度低[3-4]。開發(fā)新型藥物遞送系統(tǒng)既提高非洛地平的水溶性和溶出速度同時(shí)調(diào)控藥物釋放速率維持長(zhǎng)期穩(wěn)定血藥濃度，對(duì)于提高非洛地平的安全性、有效性以及患者的順應(yīng)性,使其在臨床上發(fā)揮更大的作用至關(guān)重要。近年來，納米材料解決難溶性藥物溶出速率而增加機(jī)體對(duì)藥物口服吸收備受青睞[5-6]。但納米材料僅成功地解決了難溶性藥物溶出速率的問題，未能改善藥物吸收后不可控的釋放引起的血藥濃度的峰谷現(xiàn)象。而滲透泵技術(shù)[3-4,7-8]298-305，823-829是以滲透壓差為驅(qū)動(dòng)力，釋藥速率符合零級(jí)釋藥動(dòng)力學(xué)特征，且釋藥行為不受環(huán)境(pH值、食物及胃腸道蠕動(dòng))等因素影響。本研究中利用納米材料中空氧化錫作為藥物載體，然后制備推拉式雙層滲透泵片，提高非洛地平的口服生物利用度。

1 儀器與材料

KSXL-1002馬弗爐(杭州卓馳儀器有限公司)，JEM-1010透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)，BT-Zeta100型納米粒度分析儀(丹東百特儀器有限公司)，IRAffinity-1紅外光譜儀，HS-DSC-101差示掃描量熱儀(上海和晟儀器科技有限公司)，ZEISS LSM 700激光共聚焦顯微鏡(上海萊瑟光譜儀器分析技術(shù)有限公司)，TDP型單沖壓片機(jī)(上海第一制藥機(jī)械廠)，RC806D溶出試驗(yàn)儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司)，UV-9100型紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，LC-2030 高效液相色譜儀(日本島津公司)。

非洛地平(武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司，批號(hào)：140220)，二氯化錫、氯化鋅、十二烷基硫酸鈉、醋酸纖維素(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，甲醇(色譜純，天津光復(fù)精細(xì)化工有限公司)，溴化鉀(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)、聚環(huán)氧乙烷(分析純，阿拉丁試劑(上海)有限公司),非洛地平緩釋片(合肥立方制藥股份有限公司，批號(hào)：191006)、Hoechst 33342，羅丹明鬼筆環(huán)肽，異硫氰酸熒光素(FITC)(北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限公司)、其余制劑均為市售分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 HMSn-FDP的制備

2.1.1 HMSn的制備[9-11]

取0.35 g SnCl2·2H2O、0.14 g ZnCl2、0.04 g NaOH和40 mL去離子水置于錐形瓶，攪拌2 h至混合均勻，將2 nmol/L NaOH溶液20 mL緩慢滴加至混合溶液，攪拌1 h，離心，沉淀物經(jīng)水洗、醇洗3次后干燥。干燥產(chǎn)物在650 ℃空氣氛圍下煅燒5 h后得到白色產(chǎn)物，在室溫條件下將白色產(chǎn)物加入20%氫氟酸溶液中攪拌分散30 min后離心，白色產(chǎn)物經(jīng)水洗3次后干燥，最后收集干燥產(chǎn)物，即得中空二氧化錫納米粒(HMSn)。

2.1.2 載藥

采用吸附法進(jìn)行載藥。取800 mg FDP溶于1 mL二氯甲烷中，加入100 mg HMSn超聲至分散均勻后攪拌過夜。離心，得到沉淀物干燥，即得HMSn-FDP。精密稱取5.0 mg HMSn-FDP置于10 mL容量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度。靜置1 h，離心，取上清液為供試品，在237 nm下測(cè)定吸光度并計(jì)算載藥量。載藥量=測(cè)得FDP的量/HMSn-FDP的量×100%

2.2 表征

2.2.1 TEM HMSn的形態(tài)結(jié)構(gòu)通過JEM-1010透射電子顯微鏡觀察，檢測(cè)電壓為200 kV。

2.2.2 DSC FDP在HMSn-FDP中存在狀態(tài)通過差示掃描量熱法在氮?dú)夥諊聶z測(cè)，溫度范圍為(50～300)℃，掃描速率10 ℃/min，繪制DSC曲線。

2.2.3 FTIR對(duì)FDP、HMSn-FDP及HMSn和FDP的物理混合物通過紅外光譜儀進(jìn)行檢測(cè)

掃描波數(shù)為(400～4000)cm-1，KBr為空白。

2.3 HMSn腸道分布實(shí)驗(yàn)

首先采用 FITC對(duì)HMSn進(jìn)行標(biāo)記得到FITC-HMSn。取220 g雄性SD大鼠，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，將FITC-HMSn經(jīng)口服給藥(10 mg/kg)，2 h后處死，取十二指腸、空腸和回腸各1 cm段，經(jīng)4%多聚甲醛固定4 h，轉(zhuǎn)移至15%、20%、30%蔗糖水溶液進(jìn)行脫水處理。取適量OCT包埋劑浸沒組織處理后進(jìn)行冷凍切片，取8 μm組織切片置于載玻片上。經(jīng)PBS洗3次后，室溫下4%多聚甲醛固定。然后PBS洗3次，在4 ℃下，用0.1% 的Triton X-100 孵育10 min。在37 ℃下1%白蛋白封閉液封閉30 min后染色。采用Hochst 33342和羅丹明鬼筆環(huán)肽染色對(duì)切片染色。染色結(jié)束PBS洗3次后封片，熒光共聚焦顯微鏡下觀察各組切片。

2.4 HMSn-FDP體外溶出實(shí)驗(yàn)

按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020版釋放度測(cè)定法第二法，考察HMSn-FDP在規(guī)定條件下的溶出速率和程度。溶出介質(zhì)為1.0% SDS水溶液，溫度為37.0 ℃，轉(zhuǎn)速為100 rpm。精密稱量相當(dāng)于5.0 mg FDP 的HMSn-FDP分散于500 mL溶出介質(zhì)。投藥后按預(yù)定時(shí)間 5、10、15、20、30、45、60、120 min取樣4 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過為供試品，取樣后補(bǔ)充等量空白釋放介質(zhì)。供試品在237 nm下測(cè)定吸光度并計(jì)算FDP累計(jì)溶出度。

2.5 HMSn-FDP滲透泵片的制備[3-4,12]298-305，823-829

2.5.1 滲透泵片芯制備

采用粉末直接壓片法制備滲透泵片芯，片芯包括藥物層和助推層兩部分，處方見表1。分別稱取處方量藥物層和助推層的原輔料，過80目篩，以等量遞加法混合均勻；采用雙層壓片技術(shù)壓制片徑為6 mm的滲透泵片芯。

表1 HMSn-FDP滲透泵片處方

2.5.2 包衣與打孔

取處方量醋酸纖維素溶于丙酮，加入處方量PEG水溶液，持續(xù)攪拌4 h混合均勻即得包衣液。將制備滲透泵片芯置于包衣鍋內(nèi)進(jìn)行包衣，轉(zhuǎn)速為35 rpm，溫度為50 ℃，待包衣增重至合格后，轉(zhuǎn)移至40 ℃烘箱內(nèi)干燥24 h。取出干燥后的包衣片，采用打孔針在藥物層和助推層的中央各打一釋藥小孔，孔徑為0.8 mm。

2.6 HMSn-FDP滲透泵片的體外釋放度考察

按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020版釋放度測(cè)定法第二法，比較HMSn-FDP滲透泵片和市售FDP緩釋片在規(guī)定條件下的體外釋放度。溶出介質(zhì)為1000 mL的0.1% SDS水溶液，溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為100 rpm。于0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12、24 h取樣5 mL，取樣后立即補(bǔ)充的等量新鮮介質(zhì)，樣品0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，在 237 nm下測(cè)定吸光度并計(jì)算FDP的累積釋放度。

2.7 HMSn-FDP滲透泵片的體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

將12只體重為2.5 kg的健康家兔隨機(jī)分為兩組，禁食12 h。家兔經(jīng)口服給予HMSn-FDP滲透泵片或FDP緩釋片，劑量為10 毫克/只。給藥后分別于0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12、24 h經(jīng)耳緣靜脈取血3 mL，置于含有肝素的EP管中，離心，取上層血漿。取1 mL 血漿樣品置于10 mL 離心管中，加入20 μL尼群地平內(nèi)標(biāo)溶液(1 ppm)，4 mL 乙酸乙酯和300 μL NaOH水溶液(1 M)，渦旋10 min，離心，取上清液，40 ℃揮干，使用50 μL流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋5 min，離心，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液為供試品溶液，經(jīng)HPLC測(cè)定血漿中FDP的濃度并繪制血藥濃度-時(shí)間曲線和計(jì)算相關(guān)體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

3 結(jié)果與討論

3.1 HMSn-FDP的制備

HMSn-FDP的合成流程圖如圖1所示。本研究采用自模板法利用共沉淀反應(yīng)合成具有立方籠式結(jié)構(gòu)的ZnSn(OH)6，然后利用酸蝕、煅燒的技術(shù)獲得具有中空立方籠式結(jié)構(gòu)SnO2納米粒(HMSn)。最后采用吸附法將FDP負(fù)載到HMSn的中空結(jié)構(gòu)中獲得HMSn-FDP。經(jīng)UV測(cè)定HMSn-FDP載藥量為(31.73±2.26)%。

圖1 HMSn-FDP制備流程示意圖

3.2 表征

通過TEM對(duì)HMSn的形貌結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2A所示。HMSn是呈單分散狀態(tài)的內(nèi)部中空的立方體式核殼結(jié)構(gòu)，粒徑約為230 nm。HMSn的殼層表面晰地可見高度有序的介孔結(jié)構(gòu)，核心的中空結(jié)構(gòu)可為藥物貯庫(kù)。負(fù)載于中空結(jié)構(gòu)中的難溶性藥物FDP因納米空間限制效應(yīng)可導(dǎo)致藥物的溶解度和溶出速率顯著增加。通過DSC對(duì)藥物FDP在HMSn中的晶型狀態(tài)進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2B所示。HMSn的DSC曲線未見任何吸熱峰，F(xiàn)DP、 HMSn和原料藥FDP的物理混合物(PM)的DSC曲線中均在145 ℃出現(xiàn)的吸熱熔融峰表明FDP處于高度的結(jié)晶狀態(tài)，而HMSn-FDP的DSC曲線中FDP吸熱熔融峰的消失表明藥物負(fù)載于HMSn中的FDP的晶型發(fā)生了改變，可能是形成無定型物質(zhì)。無定型的固態(tài)藥物的自由能低，其溶出速率高于穩(wěn)定的晶態(tài)物質(zhì)。通過FT-IR鑒定藥物FDP 和 HMSn 之間是否發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，結(jié)果如圖4所示。HMSn-FDP與HMSn和原料藥FDP的物理混合物(PM)與FDP的紅外光譜圖無明顯差異，未見新峰及任何峰的遷移，表明HMSn與FDP 未發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，F(xiàn)DP是以物理吸附的形式負(fù)載于HMSn的中空結(jié)構(gòu)。

A B C

3.3 HMSn腸道分布

通過共聚焦顯微鏡CLSM觀察FITC-HMSn在大鼠小腸中的分布情況，結(jié)果如圖3所示。大鼠小腸各個(gè)節(jié)段(十二指腸、空腸和回腸)的腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中可見大量的呈現(xiàn)綠色熒光的FITC-HMSn。HMSn經(jīng)口服后能夠快速被腸道攝取，更有利于促進(jìn)FDP的吸收，提高FDP的生物利用度。

圖3 FITC-HMSn在大鼠小腸各個(gè)節(jié)段中的激光共聚焦圖像

3.4 HMSn-FDP和HMSn-FDP雙層滲透泵片劑的體外溶出度

通過體外溶出度實(shí)驗(yàn)考察HMSn改善FDP溶出速率和程度，結(jié)果如圖4A所示。FDP原料藥在60 min的溶出度僅為(24.53±2.13)%，而HMSn-FDP則高達(dá)(92.06±3.57)%，表明HMSn能顯著提高FDP的溶出速率。對(duì)比市售緩釋片與HMSn-FDP雙層滲透泵片在1% SDS水溶液中的體外釋放度，結(jié)果如圖4B所示。市售緩釋片中FDP在6 h基本完全釋藥，而HMSn-FDP雙層滲透泵片在12 h內(nèi)幾乎維持恒定的釋藥速率。將二者的累積釋放度進(jìn)行零級(jí)動(dòng)力學(xué)釋藥方程、一級(jí)動(dòng)力學(xué)釋藥方程、Higuchi 釋藥方程數(shù)據(jù)擬合，市售緩釋片的釋放行為更符合一級(jí)模型(R22= 0.9638)，HMSn-FDP雙層滲透泵片的釋放方式符合零級(jí)模型(R12=0.9964)。

A B C

3.5 HMSn-FDP雙層滲透泵片的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)測(cè)定

HMSn-FDP雙層滲透泵片和市售緩釋片在家兔體內(nèi)血藥濃度-時(shí)間曲線結(jié)果如圖4C所示，家兔口服HMSn-FDP雙層滲透泵片和市售緩釋片相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果如表2所示。與市售緩釋片相比，HMSn-FDP雙層滲透泵片的Tmax延長(zhǎng)約2倍，Cmax僅為市售緩釋片的(72.96±0.61)%，AUC0-∞明顯升高，經(jīng)計(jì)算HMSn-FDP雙層滲透泵片的口服生物利用度提高了(121.32±0.52)%。

表2 家兔口服HMSn-FDP雙層滲透泵片和市售緩釋片相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

4 結(jié) 論

本研究采用納米材料HMSn作為FDP的藥物載體，HMSn可顯著提高難溶性藥物FDP的溶解度和溶出速度，并且HMSn經(jīng)口服后能夠快速被腸道攝取，促進(jìn)FDP經(jīng)口服的吸收。滲透泵技術(shù)有效調(diào)控FDP的釋放速率，使血藥濃度在較長(zhǎng)時(shí)間維持在治療窗范圍內(nèi)，避免血藥濃度的峰谷現(xiàn)象，提高難溶性藥物FDP的生物利用度并減少不良反應(yīng)。綜上所述，納米材料聯(lián)合控釋技術(shù)構(gòu)建高生物利用度新型遞送系統(tǒng)是提高BCS II類藥物的生物利用度一種有效制劑手段。