易 偉 陸 崟 吳晶晶 蘇 華 李 思

中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科，江蘇南京 210002

保腎片、新保腎片、腎炎寧片中主要成分均為大黃，文獻表明，大黃的抑菌性較強[1-9]，大黃中有效成分蒽醌類對葡萄球菌、鏈球菌有顯著抗菌活性[7]，同時對幽門螺桿菌[7]、大腸埃希菌[7]、肺炎克雷伯菌[8]、沙眼衣原體[9]等均有抑制作用。大黃的這種抑菌性可能影響制劑中污染的微生物，從而影響微生物檢測結(jié)果。在微生物限度檢查中，經(jīng)常遇到有抑菌性的中藥制劑，且抑菌性較難消除。若采用薄膜過濾法消除抑菌性就會使檢驗方法復(fù)雜繁瑣、工作效率低。因此急需尋找一種合適的方法來消除中藥制劑的抑菌性，建立其方便有效的檢測方法。

由于中藥制劑中利用中和劑消除抑菌性少有研究，因此本研究采用化學(xué)藥品中常用的中和劑聚山梨酯80 和卵磷脂進行實驗。文獻表明，聚山梨酯80 是一種非離子表面活性劑，可增加藥品溶解[10-12]，對微生物有一定的保護作用[13]；卵磷脂為兩性離子表面活性劑，可降低季銨類、雙胍類化合物活性，其可以修復(fù)細胞膜，對微生物無損傷作用[14-15]。兩者聯(lián)用可降低制劑的抑菌性[14-19]。本研究按照2015 年版《中華人民共和國藥典》[20]四部通則1100 生物檢查法，分別采用平皿法、稀釋法、薄膜過濾法和中和法對保腎片、新保腎片和腎炎寧片進行研究，為大黃制劑微生物限度檢查提供新思路。

1 儀器與試藥

1.1 試藥

保腎片（批號：20190426、20190527、20190612），新保腎片（批號：20190307、20190513、20190522），腎炎寧片（批號：20190506、20190520、20190701）均由中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科提供。聚山梨酯80（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20120517）；大豆卵磷脂（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20180226）。

1.2 定量菌株

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]均為第4 代，規(guī)格為（1.0～2.0）×106cfu/支，均購自北京三藥科技開發(fā)公司。

1.3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨均購自北京三藥科技開發(fā)公司，按照2015 年版《中華人民共和國藥典》[20]四部通則的要求進行培養(yǎng)基適用性檢查，均符合要求。稀釋劑：pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液，依照2015 年版《中華人民共和國藥典》[20]配制方法配制。

1.4 儀器

生物安全柜（型號：BHC-1000II/B3，蘇凈集團安泰公司）；高壓蒸汽滅菌器（型號：SQ510C，雅馬拓科技貿(mào)易有限公司）；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號：PYX-DHS.500-BS，上海躍進醫(yī)療器械有限公司）；勻漿儀（型號：HTY-761，浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司）；渦旋儀（型號：XW-80A，上海馳唐電子有限公司）；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號：PYX-DHS-40×50，上海躍進醫(yī)療器械廠）；電子天平（型號：MP1100B、MP2001，上海恒平科學(xué)儀器有限公司，精密度：0.01 g）；霉菌培養(yǎng)箱（型號：MJ-160，上海恒科有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（型號：蘇Q/WS2-175-79，連云港醫(yī)療器械設(shè)備廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的稀釋

各取一支金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、黑曲霉和白色念珠菌，放置室溫。分別吸取菌株復(fù)溶液1 mL，混勻。用pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液（稀釋劑）分別制成5000～10 000 cfu/mL 的菌懸液，備用。取4 代定量菌株大腸埃希菌一支，放置室溫后，吸取菌株復(fù)溶液1 mL，混勻。用稀釋劑制成50～100 cfu/mL 的菌懸液，備用。

2.2 計數(shù)方法適用性試驗

2.2.1 平皿法（1∶10 供試液）

2.2.1.1 供試液制備：取保腎片（新保腎片、腎炎寧片）10 g，加稀釋劑至100 mL，用勻漿儀研勻，制成1∶10供試液。

2.2.1.2 試驗組：取1∶10 供試液9.9 mL，分別加入“2.1”項下菌液0.1 mL，混勻。取1 mL 注入平皿中，加入20 mL 培養(yǎng)基，平行制備2 份，測定菌落數(shù)。用于需氧菌計數(shù)的注入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，并于30～35℃培養(yǎng)3～5 d。用于霉菌、酵母菌計數(shù)的注入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，并于20～25℃培養(yǎng)5～7 d。

2.2.1.3 菌液組：取“2.1”項下的菌液0.1 mL，加入到9.9 mL 稀釋劑中，混勻。取1 mL 注入平皿，加入20 mL培養(yǎng)基，平行制備2 份。用于需氧菌計數(shù)的注入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，用于霉菌、酵母菌計數(shù)的注入沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。測定每1 mL 菌液的菌落數(shù)。

2.2.1.4 供試品對照組：取1∶10 供試液1 mL 注入平皿中，加入相應(yīng)培養(yǎng)基，測定供試品菌落數(shù)。

2.2.1.5 陰性對照組：取稀釋劑1 mL，加入相應(yīng)培養(yǎng)基，作為陰性對照。

2.2.2 稀釋法（1∶50 供試液、1∶100 供試液）

2.2.2.1 稀釋法1：取保腎片（新保腎片、腎炎寧片）10 g，加稀釋劑至500 mL，用勻漿儀研勻，制成1∶50 供試液。將1∶50 供試液代替1∶10 供試液，其余操作同平皿法。

2.2.2.2 稀釋法2：加稀釋劑至1000 mL，其余操作同稀釋法1。

按下例公式，計算回收率。結(jié)果見表1。

試驗組回收率=（試驗組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù)×100%

由表1 可見，保腎片、新保腎片對金黃色葡萄球菌有一定的抑菌性，可采用1∶50 稀釋級供試液（稀釋法1）消除抑菌性。腎炎寧片對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌都有抑菌性，抑菌性較強，即使采用1∶100 供試液（稀釋法2），也不能消除腎炎寧片抑菌性，故考慮薄膜過濾法。

表1 平皿法和稀釋法測定結(jié)果（%）

2.2.3 薄膜過濾法

供試液、試驗組、菌液組、供試品對照組、陰性對照組的制備方法同平皿法，取試驗組、菌液組、供試品對照組1 mL，用0.1%蛋白胨300 mL 沖洗濾膜，濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基表面培養(yǎng)，測定菌落數(shù)。

腎炎寧片抑菌性較強，選取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌進行薄膜過濾試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)濾膜上有一層褐色的中藥殘渣，直接影響菌落計數(shù)。且供試液在進行過濾時，流速很慢，操作效率較低。因此腎炎寧片不適合采用薄膜過濾法，可考慮用中和法進行試驗。

2.2.4 中和法

2.2.4.1 含中和劑稀釋劑：制備含3%聚山梨酯80 和0.3%卵磷脂的稀釋劑，滅菌備用。

2.2.4.2 中和法1：取保腎片（新保腎片、腎炎寧片）10 g，加含中和劑稀釋劑至100 mL，用勻漿儀研勻，制成含中和劑的1∶10 供試液。其余操作同平皿法。

2.2.4.3 中和法2：加含中和劑稀釋劑至500 mL，其余操作同中和法1。

2.2.4.4 中和法3：加含中和劑稀釋劑至1000 mL，其余操作同中和法1。

計算各菌回收率，結(jié)果見表2。

由表2 可見，采用3%聚山梨酯80 和0.3%卵磷脂作為中和劑，保腎片和新保腎片的1∶10 供試液對金黃色葡萄球菌的回收率提高。對于腎炎寧片，當采用中和劑時，腎炎寧片的1∶10 供試液仍有抑菌性，而采用1∶50 和1∶100 稀釋級供試液可消除抑菌性，使回收率在0.5～2.0，符合2015 年版《中華人民共和國藥典》[20]四部通則規(guī)定。

表2 中和法測定結(jié)果（%）

2.3 控制菌（大腸埃希菌）檢查方法的驗證

2.3.1 直接接種法

2.3.1.1 試驗組：取“2.2.1.1”項下1∶10 供試液10 mL 及菌量≤100 cfu 的大腸埃希菌，加至100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。其余操作按2015 年版《中華人民共和國藥典》[20]四部通則中大腸埃希菌檢查法檢查。

2.3.1.2 陽性對照組：用稀釋劑代替供試液，按試驗組操作加入試驗菌，其他操作同試驗組。

2.3.1.3 陰性對照組：用稀釋劑代替供試液，不加試驗菌，其他操作同試驗組。

2.3.2 中和法

2.3.2.1 試驗組：取“2.2.4.2”項下含中和劑1∶10 供試液10 mL，其余操作同直接接中法。

2.3.2.2 陽性對照組：用含中和劑稀釋劑代替供試液，其余操作同直接接中法。

2.3.2.3 陰性對照組：用含中和劑稀釋劑代替供試液，其余操作同直接接中法。

由表3 可以看出，直接接種法和中和法均可用于3 種大黃制劑的控制菌檢查。

表3 大腸埃希菌試驗結(jié)果

3 討論

聚山梨酯80 和卵磷脂可用作中和劑降低藥品的抑菌性，文獻中多有報道[14-19]。本研究采用3%聚山梨酯80 和0.3%卵磷脂作為中和劑，中和劑對照組回收率均在1 左右，說明該中和劑無抑菌性。實驗中，在制備含中和劑稀釋劑時，應(yīng)先用聚山梨酯80 溶解卵磷脂，再加入到稀釋劑中，邊加邊攪拌，直至完全溶解，最后121℃濕熱滅菌15 min 備用。

本研究采用了平皿法、稀釋法、薄膜過濾法和中和法對保腎片、新保腎片和腎炎寧片進行微生物限度檢查法研究，比較了稀釋法、薄膜過濾法和中和法去除抑菌性的能力。本研究顯示，保腎片、新保腎片的抑菌性較低，可采用稀釋法或中和法進行試驗；腎炎寧片抑菌性較強，需采用中和法結(jié)合稀釋法才能消除其抑菌性。對于腎炎寧片，本研究也嘗試過薄膜過濾法，發(fā)現(xiàn)供試液在過濾時會堵塞濾膜，過濾速度很慢，而且濾膜上的中藥殘渣也直接影響菌落的計數(shù)。在執(zhí)行2015 版《中華人民共和國藥典》之前，離心沉淀法是可行的[21-23]，但是2015 版《中華人民共和國藥典》不再收錄此方法，也有文獻報道[24-25]離心沉淀法準確性、重現(xiàn)性差，是一種需改進的方法。由此可見，對于抑菌性較強的中藥制劑，中和法是一個不錯的選擇，既降低了供試液的稀釋度，也避免了薄膜過濾法產(chǎn)生的問題，使檢驗方法簡單化、準確化。