尹 蕾，郭麗麗*，郭 煒,任郁英，秦志梅，趙素斌

(1.河北省邯鄲市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河北 邯鄲056008；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院河北省腫瘤研究所病理研究室,河北 石家莊050011；3.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院 普外科，河北 邯鄲056002)

食管癌(Esophageal cancer,EC)是一種常見(jiàn)的消化道腫瘤，中國(guó)是全球食管癌發(fā)病率最高的幾個(gè)地區(qū)之一，在食管癌病例中約90%的病例為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)[1-2]。因此，為降低ESCC的病死率，檢測(cè)特異性腫瘤標(biāo)志物對(duì)臨床ESCC的早期診斷、治療及預(yù)后具有積極意義。

含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin type l motifs，ADAMTS)，是一類廣泛存在于哺乳動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)的分泌蛋白，具有金屬蛋白酶特性，屬于新的Zn2+依賴的金屬蛋白酶家族。目前，已發(fā)現(xiàn)的19個(gè)ADAMTSs成員，在人體的眾多生理活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，ADAMTS家族成員在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中扮演著重要的角色[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)ESCC組織及癌旁組織中ADAMTS1和ADAMTS18 mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，在基因表達(dá)水平上探討與ESCC病理參數(shù)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源及臨床資料

選取河北醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院2008-2011年間食管鱗癌手術(shù)切除的70例患者癌組織標(biāo)本，患者年齡43-76歲，平均61.2歲，其中男性52例，女性18例。全部患者術(shù)前未進(jìn)行抗腫瘤治療，術(shù)后病理檢查均確診為食管鱗狀細(xì)胞癌，手術(shù)記錄及臨床病理資料完整。按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UCC)1997年標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期，Ⅰ期2例、Ⅱ期37例、Ⅲ期28例、Ⅳ期3例；根據(jù)有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組44例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組26例；按腫瘤組織分化程度分組，高分化組16例、中分化組26例，低分化組28例。每例患者均取癌旁正常粘膜及食管癌原發(fā)灶，將距離腫瘤邊緣大于或等于5 cm的食管正常黏膜組織經(jīng)鏡檢確認(rèn)為癌旁正常組織，手術(shù)切取標(biāo)本時(shí)先取癌旁組織后取腫瘤組織。組織標(biāo)本取下后立即取部分放入液氮中冷藏，后轉(zhuǎn)于-80℃低溫冰箱保存，用于提取組織RNA。標(biāo)本的收集均與所選受試者簽署知情同意書，研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

TRIzol試劑盒購(gòu)自美國(guó)SBS公司，總RNA提取試劑購(gòu)于美國(guó)Promega公司，逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒及綠色體系購(gòu)于美國(guó)Forments公司，DNA marker 購(gòu)于北京Solarbio 科學(xué)技術(shù)有限公司，焦磷酸二乙酯(DEPC)購(gòu)自美國(guó)，ADAMTS1、ADAMTS18基因引物由賽百盛工程有限公司合成并純化，氯仿、異丙醇購(gòu)于上?；瘜W(xué)試劑總廠。

1.3 RT-PCR 法檢測(cè)ESCC組織和癌旁組織中ADAMTS1 及 ADAMTS18 mRNA的表達(dá)

ESCC組織及癌旁組織總RNA的提取采用Trizol試劑提取，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。紫外分光光度儀測(cè)定RNA的量，瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)RNA的完整性。取1 μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒說(shuō)明書步驟，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以上述制備的cDNA為模板，利用PCR擴(kuò)增出ADAMTS1、ADAMTS18及GAPDH片段。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性10 min，94℃變性45 s，退火45 s，72℃延伸 45 s，35個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后，72℃7 min，引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，采用Gel Pro Analysizer 3.1 軟件對(duì)電泳圖像中ADAMTS1及ADAMTS18 mRNA的表達(dá)量進(jìn)行半定量分析，通過(guò)與GAPDH表達(dá)量比較計(jì)算得到相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ESCC組織中ADAMTS1及ADAMTS18 基因mRNA的表達(dá)水平

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，ESCC組織中ADMATS1基因mRNA的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織[(0.384±0.113)vs(0.889±0.276)，P<0.01]，見(jiàn)圖1，表2；與癌旁組織相比，ESCC組織中ADAMTS18基因mRNA表達(dá)水平也顯著降低[(0.351±0.115)vs(0.881±0.275)，P<0.01]，見(jiàn)圖2，表2。

圖1 食管鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織中ADAMTS1 mRNA表達(dá)

圖2 食管鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織中 ADAMTS18 mRNA表達(dá)

表1 RT-PCR 引物序列、退火溫度和產(chǎn)物大小

表2 食管鱗狀細(xì)胞癌組織與癌旁正常組織中ADAMTS1、ADAMTS18 mRNA的表達(dá)

2.2 臨床病理資料與ADAMTS1及ADAMTS18基因mRNA表達(dá)的關(guān)系

ESCC患者臨床資料見(jiàn)表3。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，ADAMTS1基因mRNA表達(dá)與ESCC患者的年齡、性別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的ADAMTS1基因mRNA表達(dá)較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯升高[(0.479±0.156)vs(0.288±0.098)，P<0.05]；與低分化鱗癌組織相比，高中分化鱗癌組ADAMTS1基因mRNA表達(dá)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[(0.412±0.121)vs(0.395±0.118)，P>0.05]；TNM分期中，ADAMTS1 基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量在Ⅰ+Ⅱ期組與Ⅲ+Ⅳ期組間無(wú)顯著差異[(0.413±0.125)vs(0.379±0.112)，P>0.05]，見(jiàn)表3。

ADAMTS18基因mRNA表達(dá)與ESCC患者的年齡、性別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的ADAMTS18基因mRNA表達(dá)較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組無(wú)明顯差異[(0.349±0.113)vs(0.374±0.112)，P>0.05]；與低分化鱗癌組織相比，高中分化鱗癌組ADAMTS18基因mRNA表達(dá)量顯著增高[(0.496±0.153)vs(0.232±0.088)，P<0.05]；TNM分期中，ADAMTS18 基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量在Ⅰ+Ⅱ期組與Ⅲ+Ⅳ期組間無(wú)顯著差異[(0.368±0.109)vs(0.348±0.105)，P>0.05]，見(jiàn)表3。

表3 ADAMTS1、ADAMTS18 MRNA表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

食管癌位于我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率的第6位，發(fā)病數(shù)為24.6萬(wàn)人，而病死率位于我國(guó)惡性腫瘤死亡的第4位，死亡數(shù)為18.8萬(wàn)人[2]。ESCC為我國(guó)食管癌的高發(fā)類型，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與多種分子機(jī)制相關(guān)[4-5]。對(duì)食管癌發(fā)生及發(fā)展分子機(jī)制的研究有助于ESCC的早期診斷與靶向治療[6]。ADAMTS家族為Zn2+依賴的金屬蛋白酶家族，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，該家族的蛋白水解功能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲擴(kuò)散存在一定相關(guān)性。ADAMTS1和ADAMTS18基因的表達(dá)失調(diào)與多種腫瘤相關(guān)，但在ESCC中的作用報(bào)道較少，本文對(duì)此進(jìn)行了研究。

ADAMTS1基因位于人染色體21q21-q22，其編碼的蛋白質(zhì)含951個(gè)氨基酸，分子量約為100 kD，在人體不同組織廣泛表達(dá)，參與人體生長(zhǎng)發(fā)育、泌尿系統(tǒng)及生殖系統(tǒng)的形成、結(jié)締組織炎癥、組織器官腫瘤的發(fā)生發(fā)展、動(dòng)脈粥樣硬化等生理和病理活動(dòng)。ADAMTS1為抑癌基因，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)其在胰腺癌[7]、非小細(xì)胞肺癌[8]、前列腺癌[9]及乳腺癌[10]中表達(dá)下調(diào)。在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，浸潤(rùn)性生長(zhǎng)及向遠(yuǎn)處組織轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的兩大特征，間質(zhì)部位血管生成是其重要條件，新生血管的不斷增加將加速腫瘤的迅速生長(zhǎng)。ADAMTS1可抑制新生血管的生成，這種抗血管生成作用是通過(guò)對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF2)的調(diào)節(jié)來(lái)發(fā)揮的[11]，與ADAMTS1C-端的TSRS有關(guān)[12]。本研究通過(guò)對(duì)70例ESCC粘膜組織和70例癌旁正常黏膜組織研究發(fā)現(xiàn)，ESCC組織中ADAMTS1基因mRNA水平顯著低于癌旁正常組織，表明ADAMTS1基因的低水平表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)ESCC的發(fā)生發(fā)展，即ADAMTS1對(duì)ESCC具有抑制作用，推測(cè)這種作用是通過(guò)上述ADAMTS1抑制血管生成而發(fā)揮的。此外，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)ADAMTS1還具備促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用。胃癌患者ADAMTS1表達(dá)水平下調(diào)，但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者組織中，ADAMTS1的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者[13]。胰腺癌患者ADAMTS1表達(dá)低水平，但腹膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者ADAMTS1表達(dá)水平增高，預(yù)后較差[7]。本研究通過(guò)結(jié)合臨床資料分析顯示，ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組ADAMTS1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，這與上述研究結(jié)果一致。與此同時(shí)，ADAMTS1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中存在一些相反的作用，表現(xiàn)出組織特異性。研究發(fā)現(xiàn)其在腎癌和結(jié)腸癌細(xì)胞系中的上調(diào)表達(dá)能夠抑制肝轉(zhuǎn)移腫瘤的生長(zhǎng)，但對(duì)肺轉(zhuǎn)移的腫瘤則無(wú)此作用[14]。全長(zhǎng)ADAMTS1能促進(jìn)TA3小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移，還可以促進(jìn)Lewis肺癌血管的增殖導(dǎo)致其腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲，但其片段則表現(xiàn)為抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[15]，對(duì)腫瘤具有促進(jìn)和抑制的雙向作用，功能復(fù)雜。

ADAMTS18位于16q23，含有13個(gè)外顯子，屬于全基因組關(guān)聯(lián)基因，其編碼的蛋白質(zhì)含有1 222個(gè)氨基酸。研究發(fā)現(xiàn)，ADAMTS18在多種腫瘤組織中表達(dá)沉默，這種沉默是由其高甲基化所導(dǎo)致且與腫瘤分期無(wú)關(guān)，表明ADAMTS18在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起抑制作用[16-17]。Wei等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，ADAMTS18基因的突變可降低層黏連蛋白的黏附作用，促進(jìn)黑色素細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和轉(zhuǎn)移。本研究通過(guò)對(duì)70例ESCC粘膜組織和70例癌旁正常黏膜組織研究發(fā)現(xiàn)，ESCC組織中ADAMTS18基因mRAN水平較癌旁正常組織顯著降低，表現(xiàn)為腫瘤抑制作用，這與上述研究報(bào)道相一致。通過(guò)結(jié)合臨床資料分析顯示，ESCC高中分化鱗癌組ADAMTS18基因mRNA表達(dá)水平高于低分化鱗癌組，表現(xiàn)為隨著分化程度增高而表達(dá)減少的趨勢(shì)。對(duì)于ADAMTS18是如何發(fā)揮腫瘤抑制作用的，目前研究尚無(wú)法揭示，其可能是通過(guò)直接結(jié)合生長(zhǎng)促進(jìn)或抑制因子來(lái)調(diào)節(jié)它們?cè)谀[瘤細(xì)胞中的作用；也可能是在溶解血小板栓子方面發(fā)揮重要作用以起到腫瘤抑制作用。

隨著ADAMTS家族成員被不斷發(fā)現(xiàn)，其家族成員參與人體血管新生、細(xì)胞凋亡、炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤等多種生理病理過(guò)程的研究被不斷報(bào)道，尤其是其在腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移方面成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。對(duì)ADAMTS家族成員功能結(jié)構(gòu)及其與腫瘤關(guān)系的研究能夠幫助發(fā)現(xiàn)腫瘤特異性標(biāo)志物及其致病機(jī)制，不僅可以早期診斷腫瘤，還能為腫瘤的預(yù)后評(píng)估提供新的依據(jù)。本研究揭示了ADAMTS1和ADAMTS18 mRNA在ESCC組織中表達(dá)下調(diào)，且與腫瘤的轉(zhuǎn)移、分化具有一定相關(guān)性，但其生物學(xué)功能和在病理生理活動(dòng)中發(fā)揮的具體作用及其機(jī)制還不甚清楚，需進(jìn)一步深入研究探討。