李源繁，楊國杰，李棟博，李國棟，秦鵬，魏子寒

心絞痛是冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┑淖畛Ｒ姳憩F(xiàn)形式之一，多由暫時性心肌缺血引起，以胸痛為主要特征[1]。冠狀動脈（冠脈）側支循環(huán)形成是慢性或反復性心肌缺血繼發(fā)的一種代償機制，良好的側支循環(huán)形成有利于減輕狹窄或閉塞的冠脈缺血、缺氧，限制和縮小心肌梗死面積，改善心室功能，提高患者生存率[2,3]。冠心病患者冠脈側支循環(huán)形成個體差異較大，可能與基礎疾病、缺血時間及冠脈病變嚴重程度等有關，其具體機制尚不明確。微小RNA（miRNA）是一種高度保守的內(nèi)源性非編碼小RNA，多種miRNA與冠心病及相關性疾病發(fā)生發(fā)展密切相關，其中miR-144與冠心病嚴重程度、動脈粥樣硬化斑塊形成等有關[4-7]，但與穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈側支循環(huán)形成的關系鮮有研究。血管生成素（Ang）是一種分泌性生長因子，與血管內(nèi)皮細胞功能及炎癥反應密切相關，其中Ang1可促進血管網(wǎng)的成熟，Ang2主要刺激新生血管形成[8]。因此本研究擬分析穩(wěn)定性心絞痛患者血清miR-144、Ang1/2水平與冠脈側支循環(huán)形成的關系，以探究其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2018年10月～2019年12月于鄭州大學第一附屬醫(yī)院收治的行冠脈造影檢查確診的穩(wěn)定性心絞痛患者134例，根據(jù)Rentrop分級分為側支循環(huán)形成良好組（Rentrop分級≥2，n=76）及不良組（Rentrop分級≤1，n=58）。收集所有受試者基線資料，包括年齡、性別、基礎疾病、血壓、血脂、治療史及血清標本等。本研究經(jīng)本院的倫理委員會批準通過，所有受試患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準納入標準：符合2007年中華醫(yī)學會心血管病學分會指定的《慢性穩(wěn)定性心絞痛診斷與治療指南》[9]中穩(wěn)定性心絞痛診斷標準；臨床資料完整者；既往未接受過冠脈旁路移植術或經(jīng)皮冠脈介入治療（PCI）者。排除標準：合并嚴重肝、腎等臟器功能不全者；合并嚴重感染性疾病、血液系統(tǒng)傳染性疾病及惡性腫瘤者；合并先天性心臟病及瓣膜性心臟病者；近3月內(nèi)有急性心肌梗死病史者。

1.3 方法

1.3.1 Rentrop分級由2名經(jīng)驗豐富的心血管醫(yī)師采用雙盲法根據(jù)冠脈造影結果，采用Rentrop分級方法對側支循環(huán)形成進行分級：無側支循環(huán)形成為0級；病變遠端分支顯影為1級；病變遠端血管部分顯影為2級；病變遠端血管完全顯影為3級。其中0～1級為側支循環(huán)形成不良；2～3級為側支循環(huán)形成良好。

1.3.2 Gensini評分冠脈狹窄嚴重程度采用Gensini評分進行評價。Gensini評分系統(tǒng)按照美國心臟協(xié)會規(guī)定的冠脈血管圖像分段評價標準[10]：正常，0分；≤25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，4分；76%～90%，8分；91%～99%，16分；100%，32分。狹窄部位不同，賦予系數(shù)不同：左主干×5；左前降支近段×2.5，中段×1.5，遠段×1.0；第一對角支×1.0，第二對角支×0.5；回旋支近段×2.5，中段×1.5，遠段×1.0；后降支×1.0；后側支×0.5；右冠近、中、遠后降支×1.0。同時根據(jù)病變支數(shù)分為單支組（前降支、回旋支或右冠任意1支發(fā)生病變，血管狹窄≥50%）；2支組（前降支、回旋支或右冠任意2支有病變，至少1支血管狹窄≥70%，左主干病變屬2支組）；3支組（前降支、回旋支和右冠均發(fā)生病變，至少1支血管狹窄≥90%）。Gensini評分=（單處病變狹窄程度積分×相應系數(shù)）×總支數(shù)。

1.3.3 血清miR-144水平檢測采用Trizol試劑（Takara公司）提取血清總RNA，用紫外分光光度計檢測濃度及純度。反轉錄得到cDNA，置于-20℃保存?zhèn)溆?。采用實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RTqPCR）擴增miR-144。引物由上海生工合成。miR-144上游引物序列（5′→3′）為：ATCCAGTGCGTGTCGTG，下游引物序列（5′→3′）為：TGCTTATACAGTATAGATG；內(nèi)參U6上游引物序列（5′→3′）為：GCTTCGGCA GCACATATACTAAAAT，下游引物序列（5′→3′）為：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。20 μl反應體系：SYBR? Green Mix 10 μl，cDNA（50 ng/μl）1 μl，上下游引物（10 μM）各0.5 μl，ddH2O 8.0 μl。反應條件：95℃ 90 s；95℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 15 s，40個循環(huán)。采用2-△△CT法分析血清中miR-144相對表達水平。

1.3.4 血清Ang1/2水平檢測采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELLSA）檢測血清Ang1/2水平，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行，試劑盒均由上海澤葉生物科技有限公司提供，貨號分別為abx520454、abx511338。

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗或Fisher確切概率法進行檢驗分析。計量資料符合正態(tài)分布者以均數(shù)±標準差（）表示，兩兩比較采用t檢驗；非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，兩兩比較采用Mann-Whiteney秩和檢驗。采用Spearman法分析穩(wěn)定心絞痛患者血清miR-144、Ang1/2水平與Gensini評分的相關性；繪制受試者工作特性曲線（ROC）分析血清miR-144、Ang1/2水平對穩(wěn)定性心絞痛患者側支循環(huán)形成不良的預測價值。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料比較側支循環(huán)形成不良組與良好組穩(wěn)定性心絞痛患者年齡、性別、吸煙史、糖尿病史、血脂異常、高血壓、藥物治療史比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表1。

2.2 兩組患者Gensini評分及血清miR-144、Ang1/2水平比較與側支循環(huán)形成良好組比較，不良組穩(wěn)定性心絞痛患者血清miR-144、Ang1、Ang2水平降低，Gensini評分增加（P＜0.05），表2。

表1 兩組患者一般資料比較

表2 側支循環(huán)不良組與良好組患者血清miR-144、Ang1/2水平比較

2.3 穩(wěn)定性心絞痛患者血清miR-144、Ang1/2水平的相關性Spearman相關性分析結果顯示，穩(wěn)定性心絞痛患者血清miR-144水平與Ang1、Ang2呈正相關（r=0.402、0.404，P＜0.05），圖1。

2.4 穩(wěn)定性心絞痛患者血清miR-144、Ang1/2水平與Gensini評分的相關性Spearman相關性分析結果顯示，穩(wěn)定性心絞痛患者血清miR-144、Ang1、Ang2水平與Gensini評分均呈負相關（r=-0.707、-0.401、-0.454，P＜0.05），圖2。

圖1 穩(wěn)定性心絞痛患者血清miR-144與Ang1/2水平的相關性

圖2 穩(wěn)定性心絞痛患者血清miR-144（A）、Ang1（B）、Ang2（C）水平與Gensini評分的相關性

2.5 血清miR-144、Ang1/2水平對穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈側支循環(huán)形成不良的預測價值血清miR-144、Ang1、Ang2水平預測穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈側支循環(huán)形成不良的曲線下面積（AUC）分別為0.907（95%CI：0.851～0.962）、0.698（95%CI：0.608～0.788）、0.728（95%CI：0.454～0.812），截斷值分別為0.644、3.082 ng/ml、10.753 ng/ml，靈敏度分別為86.20%、98.30%、94.80%，特異度分別為89.50%、56.50%、46.10%。三者聯(lián)合檢測的AUC為0.915（95%CI：0.858～0.967），靈敏度及特異度分別為93.10%、90.80%，圖3。

圖3 血清miR-144、Ang1/2預測穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈側支循環(huán)形成不良的ROC曲線

3 討論

良好的冠脈側支循環(huán)形成是缺血心臟病的重要保護機制，目前評價側支循環(huán)形成的方法主要為冠脈造影，但因其為有創(chuàng)性，存在一定局限，因此尋找簡便、快捷、準確的血清學生物指標預測穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈側支循環(huán)形成對患者臨床診療及預后評估具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-144與冠心病、心肌細胞結構及功能密切相關。miR-144消融可增加波形蛋白的表達和動脈粥樣硬化斑塊的形成[5]，miR-144信號通路缺失可阻斷心肌梗死后細胞外基質重構，導致心功能惡化[11]。Gao等[12]研究報道，慢性硬膜下血腫的血腫來源外泌體通過miR-144-5p促進異常血管生成并抑制血腫吸收，推測miR-144可能與冠脈新生血管形成有關。本研究發(fā)現(xiàn)，與側支循環(huán)形成良好組比較，不良組患者血清miR-144水平顯著降低，提示miR-144水平降低可能與穩(wěn)定性心絞痛發(fā)生及其冠脈側支循環(huán)形成不良有關。

Ang在血管及動脈生成中起重要作用，Ang1和Ang2參與血管的成熟和形成，Ang1通過保持血管完整性來防止血管重構，在血管生成過程中可促進其出芽及分支[13,14]。Demir等[15]研究報道，與側支循環(huán)形成良好患者比較，側支循環(huán)形成不良的穩(wěn)定性冠心病和心力衰竭患者Ang2水平較低，而Ang1水平較高。趙松峰等研究報道，人血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及Ang2表達下調(diào)有關。本研究發(fā)現(xiàn)，與側支循環(huán)形成良好組比較，側支循環(huán)形成不良組穩(wěn)定性心絞痛患者血清Ang1、Ang2水平均顯著降低，與Demir等[15]文獻報道結果不一致，推測可能與疾病發(fā)展時期不同及選擇患者異質性有關，提示Ang1/2水平降低可能與穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈側支循環(huán)形成不良有關。基于miR-144、Ang1、Ang2均與血管生成有關，本研究采用Spearman分析其相關性，結果發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定性心絞痛患者血清miR-144水平與Ang1、Ang2水平均呈正相關，提示miR-144、Ang1、Ang2可能協(xié)同促進穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈側支循環(huán)形成。另外血清miR-144、Ang1、Ang2水平與Gensini評分均呈負相關，提示血清miR-144、Ang1、Ang2水平可能與穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈狹窄程度有關，監(jiān)測三者水平可能對患者預后評估有一定指導價值。

本研究進一步進行ROC曲線分析，結果發(fā)現(xiàn)，血清miR-144、Ang1、Ang2水平預測穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈側支循環(huán)形成不良的AUC分別為0.907、0.698、0.728，截斷值分別為0.644、3.082 ng/ml、10.753 ng/ml，靈敏度分別為86.20%、98.30%、94.80%，特異度分別為89.50%、56.50%、46.10%。三者聯(lián)合檢測的AUC為0.915，靈敏度及特異度分別為93.10%、90.80%，提示聯(lián)合血清miR-144、Ang1、Ang2可顯著提高預測穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈側支循環(huán)形成不良的特異度，更具臨床價值。

綜上所述，血清miR-144、Ang1/2水平與穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈狹窄嚴重程度呈負相關，三者聯(lián)合檢測可顯著提高預測側支循環(huán)形成不良特異度，有潛力成為預測冠脈側支循環(huán)形成的生物標志分子。但本研究樣本量少，選擇范圍局限，存在不足；關于miR-144與Ang 1/2在穩(wěn)定性心絞痛患者冠脈側支循環(huán)形成的具體作用機制，有待進一步深入探究。