鄧金華，郭曉琳，黃金輝, 張永鋒，李淑娥，鄭 璽，劉 祥，葉愛萍，穆耀輝，王平平，張立新*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100；2. 陜西省煙草公司商洛市公司, 陜西 商洛 726000；3. 陜西省煙草科學(xué)研究所, 陜西 西安 710077)

【研究意義】土壤鹽漬化是我國和全球共同面臨的環(huán)境問題，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，鹽脅迫已經(jīng)成為限制農(nóng)作物生產(chǎn)的主要威脅之一[1]。土壤中高濃度的鹽分會使植物產(chǎn)生鹽離子毒害、氧化脅迫和滲透脅迫等[2]，導(dǎo)致植物生長發(fā)育遲緩、光合作用下降，甚至造成植物死亡[3-4]。因而，植物的耐鹽機理和如何提高植物的耐鹽性始終是植物生理學(xué)和農(nóng)學(xué)所關(guān)注的重點問題[5]。高濃度的NaCl是鹽脅迫形成的主要原因[6]。因此在研究植物耐鹽性機理時，也主要集中于NaCl脅迫下植物的生理學(xué)響應(yīng)以及植物對NaCl脅迫的抵抗作用[5]?！厩叭搜芯窟M展】乙酰膽堿(ACh，acetylcholine)是動物細胞中常見的一種神經(jīng)遞質(zhì)。1914年，Ewins[7]首次在非動物細胞麥角菌中發(fā)現(xiàn)了乙酰膽堿，此后，科學(xué)家們陸續(xù)在各植物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了乙酰膽堿的存在[8]?，F(xiàn)已證實乙酰膽堿在多種高等植物體內(nèi)均有分布，但不同種屬的不同器官，其相對含量存在較大差異[9]?？茖W(xué)家對乙酰膽堿在植物內(nèi)的生理作用研究發(fā)現(xiàn)，乙酰膽堿對植物生長發(fā)育，以及調(diào)控植物抗逆性等方面起著重要作用。Yamamoto等[10]研究報道了玉米 AChE 過表達的轉(zhuǎn)基因煙草植株的耐熱性與非轉(zhuǎn)基因煙草植株相比顯著增強，表明了乙酰膽堿酯酶(AChE)對玉米耐熱性具有積極作用。Braga等[11]研究表明，在滲透脅迫下乙酰膽堿可以促進大豆幼苗生長和干物質(zhì)積累。然而，關(guān)于乙酰膽堿對植物耐鹽性調(diào)節(jié)作用的相關(guān)研究還是較為缺乏?！颈狙芯壳腥朦c】煙草(Nicotianabenthamiana)是目前研究中使用最為廣泛的模式植物之一，也是重要的經(jīng)濟作物。煙草生長迅速，且它的DNA序列簡單，易被操縱，因此煙草已被廣泛用于耐鹽脅迫的研究中，其耐鹽脅迫的機制和有關(guān)的耐鹽基因已有了比較完備的研究體系[12]。然而，比起土壤中的復(fù)雜環(huán)境條件，懸浮細胞具生長周期短，細胞群體個體均一，環(huán)境簡單易控等優(yōu)點，能更加科學(xué)、直接的體現(xiàn)細胞對耐鹽脅迫生理機制的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗選用以本氏煙葉片為材料建立懸浮細胞系，探究外源乙酰膽堿對NaCl脅迫下對煙草細胞生理生化特別是滲透調(diào)節(jié)和抗氧化代謝的影響，旨在為乙酰膽堿在提高植物耐鹽性的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙草材料為本氏煙草，種子由本課題組繁育所得，試驗于西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院理科樓D418實驗室及大型儀器平臺進行。乙酰膽堿購于楊凌天成化玻站。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+NAA 1.0 mg/L +6-BA 0.5 mg/L +蔗糖30 g/L +瓊脂15 g/L。

1.2 煙草愈傷組織、懸浮細胞培養(yǎng)體系的建立

1.2.1 本氏煙植株的培養(yǎng) 選取完整飽滿的本氏煙草種子，水浸3～4 d，取已露白的種子種于育苗盆中，種子間保持約1 cm的間距，保持土壤濕潤。置于26.5 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)四周后，選取部分幼苗的葉片進行組織培養(yǎng)，誘導(dǎo)愈傷組織。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng) 葉片消毒：選取長勢良好的本氏煙植株，用手術(shù)剪剪取幼嫩葉片，剪成邊長為5 mm的正方形。清水沖去表面灰塵。在已紫外滅菌的超凈臺中進行后續(xù)滅菌接種操作。70 %乙醇消毒30 s后，用鑷子將葉片加入1 %次氯酸鈉中消毒5 min，無菌水漂洗4～5次后用無菌濾紙吸干水分，轉(zhuǎn)入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。

恒溫培養(yǎng)：于室溫28 ℃，光照12 h/d條件下的組織培養(yǎng)間培養(yǎng)。約35 d后，獲得質(zhì)地疏松，生長旺盛的淡黃色愈傷組織。

1.2.3 懸浮細胞系的建立與繼代培養(yǎng) 選取白色疏松的愈傷組織夾散后接種于MS液體培養(yǎng)基中，每升3 g。調(diào)pH為6.8，高溫高壓滅菌。26 ℃，140 r/min搖床黑暗條件下振蕩培養(yǎng)，繼代周期為 8 d。繼代2次，新舊培養(yǎng)基的比例為10∶1。在超凈臺中操作，每次操作時用5 mL移液槍輕輕吹打，使細胞懸浮均勻分布于培養(yǎng)基中，吸取5 mL懸浮細胞接種于50 mL的新培養(yǎng)基中。

1.3 試驗設(shè)計

按照預(yù)試驗篩選出的脅迫鹽濃度(50 mmol/L NaCl)和ACh濃度(10 μmol/L)進行細胞培養(yǎng)，按表1加入試劑，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH=6.8。每組5個重復(fù)，培養(yǎng)5 d后測定相應(yīng)指標。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 細胞形態(tài)觀察 采用伊文斯藍(Evans Blue)染色法對細胞形態(tài)進行觀察。吸取10 mL懸浮細胞于離心管中，8000 r/min，離心10 min。去除多余培養(yǎng)液，用pH 7.8的PBS清洗，離心后去除多余緩沖液，再加入新鮮的PBS，重復(fù)3次，離心后去除PBS，加入1 mL的0.05 %的伊文斯藍染色液，25 ℃染色10～15 min。PBS清洗2～3次后用1 mL PBS重懸細胞。吸取10 μl滴于載玻片上，制片。顯微鏡20倍鏡觀察。

1.4.2 細胞核形態(tài)觀察 采用DAPI染色法對細胞進行染色處理，熒光顯微鏡GFP觀察。在經(jīng)磷酸緩沖液處理后的細胞懸液中加入DAPI染色液5 mL，終濃度為5 μg/mL。30 ℃黑暗條件下孵育1 d，PBS洗去多余染液，熒光顯微鏡觀察。

表1 試驗處理方式

1.4.3 端粒酶活性測定 按細胞∶PBS=1∶9的比例研磨，4 ℃ 8000 r/min離心取上清，加樣、溫育、洗滌5次，加酶標試劑后重復(fù)溫育洗滌操作，加顯色試劑顯色后終止反應(yīng)。酶標儀450 nm下測各孔的OD，計算端粒酶活性。

1.4.4 可溶性蛋白含量測定 采用考馬斯亮藍 G-250 染色法[13]測定可溶性蛋白含量。

1.4.5 脯氨酸(Pro)含量測定 使用茚三酮法測定Pro含量。在懸浮細胞中加入3 %的磺基水楊酸，沸水浴提取脯氨酸，取2 mL提取液，分別加入2 mL冰醋酸和2 mL酸性茚三酮，沸水浴30 min，冷卻后加入4 mL甲苯，充分震蕩。靜置后取上層液。以甲苯為對照對照，測A520吸光值，計算脯氨酸含量。

1.4.6 丙二醛(MDA)含量測定 采用TBA法[13]測定丙二醛(MDA)含量。

1.4.7 抗氧化保護酶類活性測定 采用NBT光還原法檢測超氧化物歧化酶(SOD)活性；紫外光吸收法測定過氧化氫酶(CAT)活性；愈創(chuàng)木酚比色法測定過氧化物酶(POD)活性[13]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用 Excel 2019 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和繪圖，使用SPSS 25.0 進行數(shù)據(jù)分析處理，用 Duncan’s 新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗(P=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源乙酰膽堿對懸浮細胞生長的影響

2.1.1 伊文斯藍染色細胞形態(tài)觀察 細胞形態(tài)是鑒定細胞受損情況和細胞活性的重要特征之一。如圖1所示，對照(CK)和10 μmol/L ACh處理下的細胞能明顯看出伊文斯藍染色劑未能穿過細胞膜進入到細胞體內(nèi)，整體呈現(xiàn)淺藍色，不能觀察到細胞核。50 mmol/L NaC(鹽脅迫組)l處理下的細胞被染為深藍色，可以看到細胞核，細胞核形態(tài)皺縮，染色質(zhì)收縮。出現(xiàn)有細胞碎片。50 mmol/L NaCl +10 μmol/L ACh處理下的細胞有破損，染色不均，出現(xiàn)死亡細胞有一些細胞可以看到被染色的細胞核，細胞核發(fā)生皺縮但比50 mmol/L NaCl處理的染色質(zhì)濃縮程度弱，整體染色比對照深，比鹽脅迫組要淺。說明ACh對煙草細胞在鹽脅迫下維持細胞形態(tài)具有一定的增強作用。

2.1.2 DAPI染色細胞核形態(tài)觀察 在鹽脅迫條件下，植物細胞的細胞核的形狀會有不同程度的變化，細胞質(zhì)凝集，細胞會出現(xiàn)凋亡狀態(tài)。且鹽脅迫導(dǎo)致的細胞內(nèi)活性氧等物質(zhì)的積累也有會對核膜造成一定程度的損傷。從圖2-a中可以看出CK組的細胞核是規(guī)則圓形，顏色均一，發(fā)出藍色熒光，亮度較強。在圖2-b中10 μmol/L ACh組的細胞核亮度暗，但形態(tài)規(guī)則呈圓形。50 mmol/L NaCl處理的細胞核體積小，拉伸變形，染色不均，應(yīng)為染色質(zhì)濃縮DNA分布不均導(dǎo)致，亮度暗，周圍有藍色熒光圍在核的四周，可能是由于細胞核內(nèi)物質(zhì)外泄所致。50 mmol/L NaCl +10 μmol/L ACh處理的細胞核發(fā)生形變，呈不規(guī)則的橢圓形，染色不均勻，其形變比50 mmol/L NaCl處理的細胞核程度要淺。說明ACh可以一定程度緩解鹽脅迫條件對細胞核的損傷。

2.1.3 外源乙酰膽堿對端粒酶活性的影響 端粒酶是一種反轉(zhuǎn)錄酶，它可以延長端粒序列，保護染色體末端序列不被分解。在動物細胞中的研究證明[14]，端粒酶可以修復(fù)細胞凋亡所導(dǎo)致的DNA損傷。植物細胞在凋亡過程中也會發(fā)生與動物細胞類似的過程，因此端粒酶活性與維持逆境下細胞DNA的完整性有密切關(guān)聯(lián)。從圖3可見，10 μmol/L ACh處理的端粒酶活性最高，表明在正常環(huán)境下外源ACh對煙草細胞中端粒酶活性有一定的增強作用，但是差異不顯著。而在鹽脅迫條件下，50 mmol/L NaCl處理比CK組降低了33.1 %，說明在鹽脅迫環(huán)境會導(dǎo)致細胞端粒酶活性降低，使得細胞染色體受損。50 mmol/L NaCl +10 μmol/L ACh處理的細胞端粒酶活性是50 mmol/L NaCl處理的1.47倍，與對照組的端粒酶活性差異不顯著。表明ACh對保護端粒酶，維持端粒酶活性方面有重要作用。ACh可以通過提高端粒酶活性來緩解鹽脅迫對DNA造成的損傷，保護染色體從而減少細胞凋亡。

2.2 外源乙酰膽堿對懸浮細胞滲透調(diào)節(jié)的影響

2.2.1 外源乙酰膽堿對細胞內(nèi)可溶性蛋白含量的影響 由圖4分析所得，10 μmol/L ACh處理的細胞內(nèi)可溶性蛋白含量較對照(CK組)處理增加了18.1 %，但差異不顯著。而50 mmol/L NaCl 處理的細胞內(nèi)可溶性蛋白含量顯著下降，較CK組降低了28.4 %。50 mmol/L NaCl +10 μmol/L ACh處理下的可溶性蛋白含量較NaCl處理顯著增加，提高了49.3 %。綜合分析可得，在鹽脅迫條件下，細胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)下降，細胞的滲透調(diào)節(jié)能力降低，通過添加外源ACh可以顯著增加煙草細胞中可溶性蛋白含量，對植物的滲透調(diào)節(jié)具有積極的作用。

2.2.2 外源乙酰膽堿對細胞內(nèi)脯氨酸(Pro)積累的影響 如圖5所示，10 μmol/L ACh處理的細胞內(nèi)脯氨酸含量較對照組略有提高，但差異不顯著。50 mmol/L NaCl處理的Pro含量與CK組相比差異顯著，減少了63.39 %。50 mmol/L NaCl +10 μmol/L ACh 處理的細胞內(nèi)Pro含量較50 mmol/L NaCl處理顯著提高，約增加了一倍，但相較于對照組，還存在顯著的差異。綜合分析，在鹽脅迫條件下，細胞中Pro含量會顯著下降，從而影響煙草細胞的滲透調(diào)節(jié)，通過添加外源乙酰膽堿，可以部分緩解高濃度NaCl導(dǎo)致的滲透脅迫。

2.3 外源乙酰膽堿對懸浮細胞抗氧化特性的影響

2.3.1 外源乙酰膽堿對細胞丙二醛(MDA)積累的影響 MDA使細胞膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量代表著氧化脅迫對細胞膜脂質(zhì)雙分子層過氧化的程度[15]。由圖6可以得出，正常生理條件下(CK組)的MDA含量較少，而10 μmol/L ACh處理的細胞中MDA含量積累減少，比對照降低了14.8 %，但差異不顯著。50 mmol/L NaCl處理模擬鹽脅迫的細胞內(nèi)MDA的積累量顯著增加，比CK組增加了121.8 %。而50 mmol/L NaCl +10 μmol/L ACh 處理的細胞中MDA含量比CK組增加了43 %，差異不顯著；較50 mmol/L NaCl處理減少了35.3 %，差異顯著。表明在鹽脅迫的環(huán)境下，會使細胞產(chǎn)生氧化脅迫，導(dǎo)致MDA的濃度升高，通過添加外源ACh能顯著減少MDA，從而有效的保護細胞膜系統(tǒng)不被過氧化損傷。

2.3.2 外源乙酰膽堿對SOD活性的影響 由圖7可見，10 μmol/L ACh處理的細胞內(nèi)SOD活性較CK組差異不顯著。在鹽脅迫環(huán)境下(50 mmol/L NaCl處理)的細胞內(nèi)SOD活性較對照組顯著降低，比CK組降低了56.5 %。50 mmol/L NaCl +10 μmol/L ACh 處理的細胞內(nèi)SOD活性較50 mmol/L NaCl處理顯著增加，其SOD活性為50 mmol/L NaCl處理的2.07倍，且與CK組差異不顯著。綜合表明，外源ACh可以提高鹽脅迫下煙草細胞內(nèi)的SOD活性。

2.3.3 外源乙酰膽堿對CAT活性的影響 如圖8所示，10 μmol/L ACh處理的細胞內(nèi)CAT酶活性與CK組沒有顯著差異。50 mmol/L NaCl處理的CAT活性較CK組顯著降低，僅為CK組的35.47 %。50 mmol/L NaCl +10 μmol/L ACh 處理的CAT活性較50 mmol/L NaCl處理顯著提高；但與對照組也有顯著差別，為CK組的79.78 %。綜合分析可知，鹽脅迫會降低細胞內(nèi)CAT活性，而外源施加ACh可以使CAT活性接近正常細胞。

2.3.4 外源乙酰膽堿對POD活性的影響 由圖9可見，各種處理下培養(yǎng)5 d的煙草懸浮細胞間POD的活性變化。10 μmol/L ACh處理的POD活性與CK組之間相比無顯著差異。50 mmol/L NaCl處理的POD活性較CK組下降了37.1 %。50 mmol/L NaCl +10 μmol/L ACh處理的POD活性比50 mmol/L NaCl處理增加了27.9 %。綜合分析可知，添加外源Ach可以一定程度提高鹽脅迫下POD活性，從而減輕高鹽分導(dǎo)致的氧化損傷。

3 討 論

鹽脅迫會導(dǎo)致植物的離子失衡和高滲脅迫，進而導(dǎo)致植物發(fā)生氧化脅迫，其表現(xiàn)是多方面的，鹽脅迫會使植物中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，如可溶性蛋白和脯氨酸含量減少，從而減弱植物的耐受滲透脅迫的能力；此外，鹽脅迫會使植物發(fā)生生理性失水，在水分脅迫下植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧，活性氧會使細胞膜受損，加劇MDA的積累，抗氧化酶類活性下降；同時，活性氧也會使葉綠素發(fā)生降解，降低光合作用，進而碳同化反應(yīng)受到抑制，這樣就導(dǎo)致植株生長緩慢和干物質(zhì)的大量消耗，甚至死亡。大量研究表明脫落酸(ABA)、油菜素內(nèi)酯(BLs)、水楊酸(SA)和褪黑素(MT)等植物激素的適當(dāng)施用可能在植物鹽脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和適應(yīng)性調(diào)控中參與積極的作用[16-19]。乙酰膽堿是一種類似于植物激素的化學(xué)物質(zhì)，但其在植物耐鹽性領(lǐng)域的研究較少?？扇苄缘鞍鬃鳛橐环N重要的營養(yǎng)物質(zhì)，可以調(diào)節(jié)細胞滲透壓，保護生物膜，對植物耐鹽脅迫起重要作用[20-21]。脯氨酸是細胞內(nèi)重要的小分子有機物，在細胞內(nèi)常以游離形態(tài)存在。由于氨基酸的兩性特征，Pro在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)酸堿平衡中起著重要作用，因此Pro被認為是有效的有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一[22]。Pro還可以作為信號分子調(diào)節(jié)線粒體功能，影響細胞增殖或死亡[23]。本試驗條件下，施用外源ACh(10 μmol/L)可顯著提高鹽脅迫下細胞中可溶性蛋白和脯氨酸的含量，增強植物對高鹽分導(dǎo)致的滲透脅迫的耐受性，提高細胞的滲透調(diào)節(jié)能力。

MDA是植物受到脅迫損傷后，細胞脂質(zhì)膜過氧化的產(chǎn)物，MDA含量可以作為脂膜過氧化的指標，間接的判斷細胞膜系統(tǒng)的受損程度[24]。在煙草懸浮細胞抵抗鹽脅迫環(huán)境的過程中，細胞內(nèi)MDA的含量積累的越多，說明膜系統(tǒng)受損程度就越嚴重。植物體內(nèi)存在著能清除活性氧的膜系統(tǒng)保護酶系，主要有超氧物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等，以維護體內(nèi)活性氧代謝的平衡，保護自己免受活性氧的傷害[25]。SOD是植物抗氧化系統(tǒng)第一道防線[26]，SOD可以通過歧化反應(yīng)消除植物由于鹽脅迫產(chǎn)生的大量活性氧，減輕氧化損傷[24]。SOD分解活性氧產(chǎn)生的過氧化氫通常由POD和CAT將其分解成對細胞無害的H2O和O2。本研究表明，乙酰膽堿(10 μmol/L)可以減少MDA的積累，提高細胞內(nèi)抗氧化酶類SOD、CAT和POD的活性，增強植物的抗氧化能力。黃麗英[27]也發(fā)現(xiàn)褪黑素預(yù)處理可以增強鹽溶液灌根條件下黃瓜幼苗中SOD、CAT和POD的活性，顯著地降低MDA含量。說明乙酰膽堿可能也參與植物的氧化脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和適應(yīng)性調(diào)控中。

本研究還發(fā)現(xiàn)，乙酰膽堿可一定程度緩解高鹽分對細胞的損傷，減輕染色質(zhì)的收縮，增強細胞內(nèi)端粒酶活性。目前，關(guān)于乙酰膽堿的研究多集中于對植物的生長、發(fā)育和代謝的調(diào)控，在逆境生理這一領(lǐng)域研究相對較少。本研究初步分析了乙酰膽堿對煙草細胞的在鹽脅迫下的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化代謝的影響，但其作用機理和信號途徑還需做進一步研究。

4 結(jié) 論

本試驗研究了添加外源10 μmol/L的乙酰膽堿對 50 mmol/L NaCl模擬鹽脅迫條件下煙草細胞形態(tài)、滲透調(diào)節(jié)和抗氧化代謝的影響。結(jié)果表明施用一定量的乙酰膽堿可一定程度緩解高鹽分對細胞的損傷，減輕染色質(zhì)的收縮；可顯著提高細胞內(nèi)可溶性蛋白和脯氨酸的含量，增強植物在鹽脅迫下的滲透調(diào)節(jié)能力；還可以提高鹽脅迫下細胞內(nèi)抗氧化酶類SOD、CAT和POD的活性，增強植物的抗氧化能力。綜合表明，ACh對提高植物的耐鹽性起著一定的作用。