李靜雯，董亞超，肖永貴，李法計，楊舒蓉，李 鳴，夏先春，何中虎,3

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅蘭州 730070； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所國家小麥改良中心，北京 100081; 3.CIMMYT中國辦事處,北京 100081)

小麥?zhǔn)俏覈谌蠹Z食作物，其產(chǎn)量的穩(wěn)步提升對于保障國內(nèi)糧食安全具有重大意義[1]。單位面積穗數(shù)、穗粒數(shù)和粒重構(gòu)成小麥產(chǎn)量三要素[2]。研究表明，千粒重的提高對小麥產(chǎn)量潛力提升貢獻較大[3-5]。籽粒大小和籽粒灌漿程度直接決定小麥粒重[6]，粒重與籽粒大小、形狀(粒長、粒寬、籽粒長寬比和粒厚)正相關(guān)[7]，且受多個微效基因控制。因此，深入了解粒重基因及其分子標(biāo)記對于提升小麥產(chǎn)量潛力具有重要意義[8]。

近年來小麥粒重相關(guān)基因研究取得了一定進展，已克隆出多個粒重相關(guān)基因，包括TaGW2-6A、TaGW2-6B[9-11]、TaGS-D1[12]、TaGS5-A1[13]、TaTGW6[14-15]、TaGW8-B1[16]、TaGL3-5A[17]、TaSDIR1-4A[18]、TaSus2-2B[19]、TaSus2-2A、TaSus1-7A[20]、TaCwi-A1[21]、TaCWI-D1[22]、TaCKX6-D1[23]、TaCYP78A3[24]、TaTPP-6AL1[25]、TaSAP1-A1[26]、Tabas1-B1[27]、Ta-6-SFT[28]、TaGS1[29]、TaBT1[30]、TaSST[31]、TaSnRK2.10[32-33]、TaSnRK2.9-5A[34]等。上述粒重相關(guān)基因的克隆、功能標(biāo)記的開發(fā)及其與農(nóng)藝性狀關(guān)系的研究，為了解粒重的分子遺傳機理及利用功能標(biāo)記加快小麥高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)育種進程提供了重要信息。

早期研究顯示，水稻OsGS5編碼的絲氨酸羧肽酶類蛋白(serine carboxypeptidase-like proteins，SCPLs)可影響籽粒灌漿，在調(diào)控水稻籽粒大小和粒重方面發(fā)揮著重要作用[35]。Xu等[36]研究發(fā)現(xiàn)，SCPLs已在多種植物中得到鑒定，表明其廣泛參與植物體生長發(fā)育調(diào)控過程。Wang等[13]利用水稻OsGS5基因的生物學(xué)信息，克隆了普通小麥3A染色體上TaGS5-A1基因的全長編碼序列，并針對其等位變異TaGS5-A1a和TaGS5-A1b開發(fā)了共顯性酶切擴增多態(tài)性序列(cleaved amplified polymorphic sequences，CAPS) 功能標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)小麥TaGS5-A1基因?qū)τ谧蚜４笮【哂姓蛘{(diào)控作用，攜帶其優(yōu)異等位基因TaGS5-A1b的小麥品種具有較寬的粒寬和更高的千粒重，在小麥高產(chǎn)育種中有較大的應(yīng)用潛力。簡大為等[37]和Li等[38]先后將TaGS5-A1基因CAPS功能標(biāo)記用于檢測新疆及黃淮麥區(qū)小麥，發(fā)現(xiàn)TaGS5-A1b基因型材料在新疆改良品種和黃淮麥區(qū)分布頻率均高于50%，后者還驗證了TaGS5-A1b基因與高粒重相關(guān)。

KASP技術(shù)作為一種高通量的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)或插入、缺失(insertion/deletion，InDel)基因分型平臺，已廣泛用于作物育種。近年來，小麥基因特異性KASP標(biāo)記已被大量開發(fā)[39]，并在實踐中得到有效應(yīng)用[40]。利用KASP 標(biāo)記檢測了109個長江上游小麥品種粒重等6個性狀20個位點的基因型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)材料為TaGS5-A1b基因型[41]。但是關(guān)于小麥主要粒重基因TaGS5-A1的 KASP標(biāo)記在育種中的應(yīng)用價值報道較少。

本研究以本課題組基于粒重基因TaGS5-A1開發(fā)的高通量KASP標(biāo)記檢測黃淮麥區(qū)119個小麥品種，了解其等位變異分布頻率，并比較攜帶不同等位變異品種的粒重構(gòu)成要素，探討等位變異TaGS5-A1b和TaGS5-A1a的育種價值，以期為利用粒重分子標(biāo)記進行基因聚合和培育高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)小麥品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究采用119個小麥品種作為試驗材料，其中，黃淮麥區(qū)(安徽、河北、河南、江蘇、山東、山西和陜西7個省份)推廣品種101個，適宜黃淮麥區(qū)生長的國外品種18個，該群體源于黃淮麥區(qū)具有代表性的166個小麥品種[42-44]。品種基本信息見表1。試驗材料于2012-2013和2013-2014年度種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院安陽棉花所白壁試驗站(36°3′ N，114°29′ E，海拔65 m)和安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院濉溪試驗站(33°53′ N，116°46′ E,海拔 30 m)，2014-2015年度種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院安陽棉花所白壁試驗站和河北省石家莊市高邑縣原種場(37°37′ N，114°36′ E,海拔45 m)。田間種植采用隨機區(qū)組設(shè)計，3行區(qū)，行長2 m，3次重復(fù)。田間管理措施同當(dāng)?shù)卮筇铩?/p>

表1 119個小麥品種的基本信息和基因型Table 1 Basic information and genotypes of 119 wheat varieties

(續(xù)表1 Continued table 1)

1.2 性狀調(diào)查

調(diào)查性狀包括千粒重、粒長、粒寬、穗長、株高和穗下節(jié)長。于小麥成熟期，每個小區(qū)隨機選取20個穗子、10個單株分別測定穗長、株高和穗下節(jié)長，以小麥根莖結(jié)合處與頂部小穗之間的距離代表植株高度，以穗下部往下到第一個結(jié)節(jié)處的長度作為穗下節(jié)長。于小麥成熟后，單株收獲脫粒，用萬深SC-G型自動考種分析儀測定千粒重、粒長和粒寬。119個小麥品種的表型數(shù)據(jù)由Li等[44]調(diào)查提供。

1.3 小麥葉片DNA提取

每個品種挑選8粒種子，發(fā)苗7～10 d后，剪取一定量的葉片，采用高鹽、低pH法提取DNA[45]。

1.4 基因型分型

采用粒重基因TaGS5-A1特異性KASP標(biāo)記進行基因型分型，該基因標(biāo)記由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所何中虎課題開發(fā)，具體引物序列見表2。根據(jù)KASP標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)方法對119個小麥品種TaGS5-A1基因的目標(biāo)SNP位點進行KASP分析。

PCR反應(yīng)在SNPline水浴PCR熱循環(huán)儀Hyfrocycler2(LGC，英國)384孔PCR板進行，每個PCR反應(yīng)體系為5.0 μL，包含2.0 μL 50 ng·μL-1的DNA，2.5 μL 2×KASP Master Mix，0.056 μL引物混合液，用ddH2O補充至5 μL。兩個上游引物和共用下游引物的濃度分別為12 μmol·L-1和30 μmol·L-1。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃變性15 min；94 ℃變性20 s，65～55 ℃退火/延伸1 min，10個循環(huán)(從第二個循環(huán)開始每個循環(huán)降1 ℃)；94 ℃變性20 s，57 ℃退火/延伸1 min，32個循環(huán)。用Synergy H1型多功能酶標(biāo)儀(BioTek，美國)讀取熒光值，用KlusterCaller軟件(KBioscience)分型。若熒光信號弱、分群較分散，則影響數(shù)據(jù)分析，可以加3個循環(huán)(94 ℃變性20 s,57 ℃退火/延伸1 min)，直至結(jié)果滿意為止。

表2 TaGS5-A1位點、染色體、等位基因及引物序列Table 2 TaGS5-A1 locus,chromosome,alleles and primer sequences for detecting allelic variations

1.5 統(tǒng)計分析

用Excel 2010對每種基因型對應(yīng)小麥品種的千粒重、粒長、粒寬、株高、穗長、穗下節(jié)長平均值分別進行統(tǒng)計分析。用SPSS 20.0對上述性狀3年2點數(shù)據(jù)[44]進行方差分析。KASP結(jié)果判讀中排除DNA 樣本檢測顯示為缺失的數(shù)據(jù)，不予分析。采用t測驗進行TaGS5-A1位點不同等位變異的顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 籽粒等主要農(nóng)藝性狀的表型分析結(jié)果

從表3可以看出，基因型、環(huán)境及基因型與環(huán)境互作對所有檢測性狀均有極顯著影響(P< 0.01)，說明基因型、環(huán)境及基因型與環(huán)境互作均影響籽粒相關(guān)農(nóng)藝性狀。

表3 籽粒及穗部部分性狀的方差分析Table 3 Analysis of variance for grain and spike related traits

2.2 119個小麥品種 TaGS5-A1基因等位變異的分布頻率

從圖1可以看出，含有TaGS5-A1b等位基因的品種有91個，分布頻率為76.5%；含有TaGS5-A1a等位基因的品種有28個，分布頻率為23.5%，等位基因TaGS5-A1b的分布頻率明顯高于TaGS5-A1a。

2.3 TaGS5-A1基因等位變異的效應(yīng)分析

從表4可以看出，含有TaGS5-A1b等位基因品種與含有TaGS5-A1a等位基因品種間的千粒重和粒寬差異均達到極顯著水平，前者較后者增幅分別為6.6%和3.0%，說明TaGS5-A1b等位變異可增加小麥籽粒的粒重和粒寬。此外，含有TaGS5-A1b等位基因品種較含TaGS5-A1a基因的株高顯著降低，降幅為6.6%，但其粒長(7.0 mm)、穗長(9.3 cm)、粒長/粒寬(2.0)和穗下節(jié)長(26.8 cm)均與含有TaGS5-A1a等位基因的品種間無顯著差異，說明TaGS5-A1主要是通過增加粒寬來提高千粒重。

2.4 黃淮麥區(qū)不同省份小麥品種 TaGS5-A1基因等位變異的分布頻率

對黃淮麥區(qū)河北(9個)、河南(42個)、山東(22個)、安徽(9個)、陜西(15個)小麥品種TaGS5-A1基因等位變異的分布頻率進行分析，結(jié)果(表5)表明，TaGS5-A1b在安徽、河南、山東小麥品種的分布頻率分別為100%、88.1%、 81.8%，在河北和陜西小麥品種的分布頻率均為 66.7%。河北、安徽、陜西三省的小麥品種數(shù)目有限，統(tǒng)計結(jié)果僅供參考。但總的來看，TaGS5-A1b等位變異在黃淮麥區(qū)5省的分布頻率明顯高于TaGS5-A1a。

表4 TaGS5-A1基因等位變異品種間粒型等農(nóng)藝性狀的比較Table 4 Comparison of grain shape and agronomic traits between TaGS5-A1a and TaGS5-A1b allele varieties

表5 黃淮麥區(qū)不同省份小麥品種 TaGS5-A1基因等位變異的分布頻率Table 5 Allelic frequencies at TaGS5-A1 locus in wheat varieties from different provinces in Huanghuai wheat area

3 討 論

3.1 TaGS5-A1基因KASP標(biāo)記的驗證

近十年來，模式植物水稻和擬南芥中與籽粒大小相關(guān)的遺傳研究蓬勃發(fā)展。通過正向遺傳學(xué)手段如數(shù)量性狀位點的圖位克隆和T-DNA插入突變體庫已克隆出40多個控制籽粒大小的基因[46]。這些基因主要與三個遺傳途徑有關(guān)，包括蛋白酶體的降解，G蛋白信號和植物激素[47-49]?？刂屏Ｐ蔚幕虼蠖嗾{(diào)控籽粒的細胞分裂，而控制籽粒灌漿的基因則主要影響源庫關(guān)系。在細胞水平，GS5基因主要通過促進細胞分裂來增加細胞數(shù)目，進而調(diào)控籽粒大小和粒重[35]。

功能標(biāo)記作為育種應(yīng)用的理想標(biāo)記，經(jīng)驗證優(yōu)化后可用于所有育種材料的檢測和分子標(biāo)記輔助選擇[50]。本研究利用粒重基因TaGS5-A1的KASP標(biāo)記對黃淮麥區(qū)119個小麥品種該位點等位變異分布及效應(yīng)進行分析，發(fā)現(xiàn)TaGS5-A1b等位基因的分布頻率達76.5%，在6個環(huán)境中攜帶該等位基因的小麥品種具較寬的粒寬和更高的千粒重(P<0.01)，這與采用該基因CAPS標(biāo)記的分析結(jié)果一致[37-38]，驗證了TaGS5-A1基因的KASP標(biāo)記的有效性和實用性，可用于小麥粒重的輔助選擇。

Wang等[13]將TaGS5-A1基因定位到3AS染色體上，其側(cè)翼標(biāo)記為Barc356 和 Barc324，其中攜帶TaGS5-A1a等位基因材料的株高、穗長、穗下節(jié)顯著高于含有TaGS5-A1b基因型的材料(P<0.05)。本研究攜帶TaGS5-A1b的材料株高顯著低于含有TaGS5-A1a的材料，這與前人研究結(jié)果一致，但兩個等位基因材料間的穗長、穗下節(jié)長無顯著差異。已有研究表明，3A 染色體上與小麥千粒重相關(guān)的QTL與SSR分子標(biāo)記 Barc356 緊密連鎖[51]，該染色體上與株高有關(guān)的 QTL位于分子標(biāo)記 Barc324和 Xwmc428之間[52]。類似地，定位于2BL染色體上控制產(chǎn)量和株高的QTLs區(qū)域含有粒重基因TaSus2-2B，且攜帶該基因優(yōu)勢等位變異Hap-H的小麥品種在2個環(huán)境下株高均顯著降低[11]。由于控制小麥粒重的主效QTL或基因經(jīng)常與其他性狀緊密連鎖，存在一因多效的現(xiàn)象，那么本研究中粒重基因TaGS5-A1是否與株高QTL緊密連鎖，還有待于進一步驗證。

粒重性狀容易受氣候、土壤、生產(chǎn)條件和栽培措施等因素的影響，造成不同地區(qū)不同年份籽粒質(zhì)地、重量差異較大。本研究通過多年多點試驗，獲得連續(xù)3個生長周期共6個環(huán)境的表型數(shù)據(jù)，更準(zhǔn)確地評價了粒重基因TaGS5-A1的效應(yīng)及其KASP標(biāo)記輔助選擇的應(yīng)用價值。

3.2 TaGS5-A1b等位基因的分布頻率

本研究發(fā)現(xiàn)黃淮麥區(qū)小麥各主產(chǎn)省份TaGS5-A1b等位基因的分布頻率不同，但總體趨勢一致，表明該粒重基因優(yōu)異等位變異在黃淮麥區(qū)不同省份均被不同程度地正向選擇，但是TaGS5-A1b等位基因的粒重改進潛力在不同省份有所差異。陜西省攜帶TaGS5-A1b等位基因小麥品種的粒重(41.9 g)高于TaGS5-A1a等位基因(39.2 g)的品種，可能是品種數(shù)偏少所致；其粒寬(3.4 mm)顯著高于TaGS5-A1a基因型材料(3.3 mm)，表明陜西省品種粒重改進潛力大。山東省選育的攜帶優(yōu)勢等位變異TaGS5-A1b小麥品種的千粒重(45.5 g)、粒寬(3.5 mm)均顯著高于TaGS5-A1a基因型(41.2 g，3.4 mm)，進一步驗證了TaGS5-A1b基因型與千粒重顯著正相關(guān)，而且與宋健民等[53]發(fā)現(xiàn)山東省1999-2010年育成的小麥品種產(chǎn)量構(gòu)成要素中粒重呈顯著上升結(jié)果相印證。

3.3 TaGS5-A1b基因功能標(biāo)記在育種中的應(yīng)用

粒重作為多基因控制的數(shù)量性狀，以表型為主的選擇可能造成優(yōu)異基因的丟失，而以分子標(biāo)記跟蹤能確保優(yōu)異基因的保留。所以常規(guī)育種與分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合可提高對粒重選擇的準(zhǔn)確性和育種效率[54]。目前國內(nèi)學(xué)者利用粒重基因特異性分子標(biāo)記快速準(zhǔn)確鑒定出不同小麥品種中粒重形成相關(guān)基因及其變異類型的分布，為小麥高產(chǎn)育種過程中親本選配和后代輔助選擇提供依據(jù)[8]。本研究主要基于TaGS5-A1基因?qū)αＶ氐脑鲂нM行了驗證，明確攜帶優(yōu)異等位變異TaGS5-A1b小麥品種的粒重較高。粒重較高的品種如中麥875(52.8 g)、豫麥34(50.8 g)、魯麥23(50.7 g)和中麥895(49.8 g)均攜帶與其高粒重表型一致的優(yōu)異等位變異TaGS5-A1b。研究發(fā)現(xiàn)，中麥895還具有4個位點的優(yōu)異等位變異，即Hap-A、Hap1/2/3、Tabas1-B1a和TaCwi-A1a；豫麥34還具有3個位點的優(yōu)異等位變異Hap-A、Hap1/2/3和TaCwi-A1a；中麥875還具有2個位點的優(yōu)異等位變異Hap-A和Hap1/2/3；魯麥23僅有1個位點的優(yōu)異等位變異，為Hap-A。以上小麥品種應(yīng)該還存在其他粒重基因的優(yōu)異等位變異，需要進一步明確這些高粒重品種中影響粒重的變異位點，評價相關(guān)位點的高通量KASP標(biāo)記。因此，今后在利用本研究篩選的粒重基因TaGS5-A1高通量KASP標(biāo)記時，應(yīng)在綜合考慮基因、環(huán)境以及植株本身優(yōu)良性狀的基礎(chǔ)上，結(jié)合其他多個粒重和品質(zhì)基因標(biāo)記進行基因聚合，可加速培育出具有突破性的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)小麥新品種。