何國(guó)成，賈曉菲，何思聰，周婉儀，張益文

(中山市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)所，廣東 中山 528437)

1 引言

β-受體激動(dòng)劑屬于苯乙醇胺類(lèi)藥物，也稱(chēng)為β-腎上腺素能受體激動(dòng)劑，醫(yī)學(xué)上常用于治療呼吸道疾病，同時(shí)其在生物體內(nèi)還具有“再分配效應(yīng)”，促進(jìn)生物體內(nèi)脂肪的分解，并為蛋白質(zhì)合成提供有利條件，故俗稱(chēng)“瘦肉精”。β-受體激動(dòng)劑在臨床上用于人體劑量較低，但是一些動(dòng)物飼養(yǎng)者有時(shí)會(huì)違法在動(dòng)物飼料中添加大劑量的β-受體激動(dòng)劑來(lái)提高牲畜瘦肉率和飼料轉(zhuǎn)化率[1]。動(dòng)物攝入后主要蓄積在肝臟和腎中，人體攝入過(guò)量的β-受體激動(dòng)劑會(huì)出現(xiàn)心率加快癥狀，進(jìn)而加重心腦血管、糖尿病、冠心病等患者癥狀。為保證β-受體激動(dòng)劑殘留量檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，科學(xué)地描述整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生的誤差，按照 《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》中的規(guī)定，實(shí)驗(yàn)室的每個(gè)證書(shū)或報(bào)告必須要有不確定評(píng)定的說(shuō)明，以便規(guī)范實(shí)驗(yàn)室管理，保證檢驗(yàn)工作質(zhì)量[2]。不確定度是與測(cè)量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，表征賦予被測(cè)量值的分散性，不確定度的評(píng)定在量值溯源方面具有重要意義[3]。本文采用《農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-18-2008》[4]檢測(cè)方法對(duì)豬肝中的沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺這3種β受體激動(dòng)劑種類(lèi)殘留量的不確定度進(jìn)行評(píng)定，為檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性提供技術(shù)依據(jù)，同時(shí)也為其他實(shí)驗(yàn)室采用內(nèi)標(biāo)法評(píng)定不確定度提供參考。

2 材料和方法

2.1 材料試劑

2.1.1 樣品

取陰性豬肝樣品，約200 g，去筋膜后經(jīng)攪拌機(jī)攪拌至肉糜狀態(tài)。

2.1.2 試材

沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度為99.90%，擴(kuò)展不確定度為U=0.30%，DR公司)，克倫特羅(純度為97.08%，擴(kuò)展不確定度為U=0.30%，DR公司)標(biāo)準(zhǔn)品，萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度為95.00%，擴(kuò)展不確定度為U=0.71%，DR公司)，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)：沙丁胺醇D3，克倫特羅D9，萊克多巴胺D6均為DR公司。高氯酸和氨水(優(yōu)級(jí)純，廣州化學(xué)試劑廠)、正己烷(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)、甲醇和乙腈(色譜純，F(xiàn)isher chemical)、水為一級(jí)水等。陽(yáng)離子交換柱(安捷倫PCX 3CC 60 mg)，50 mL聚丙烯離心管。

2.2 儀器與設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(安捷倫1290液相-6495串聯(lián)質(zhì)譜儀)，旋渦振蕩器(IKA Vortex 2)，冷凍高速離心機(jī)(Sigma 3-18ks)，固相萃取裝置，全自動(dòng)樣品濃縮儀(Biotage Turbo Vap LV)，感量0.01 mg分析天平(Mettler SEX2505DU)，pH計(jì)(Mettler S400-K)等。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱(chēng)量沙丁胺醇50.05 mg、克倫特羅51.50 mg、萊克多巴胺52.63 mg，用甲醇定容至50 mL，配制成濃度分別為1000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密吸取100 μL濃度為1000 μg/mL的沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至同一10 mL容量瓶中，用甲醇配制成10.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。精密量取100 μL濃度為10.0 μg/mL的沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺混合標(biāo)準(zhǔn)中間液至另一10 mL容量瓶中，用10%甲醇配制成100ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。同時(shí)將沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品按上法配制成100 ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液。標(biāo)準(zhǔn)溶液均放置于4℃避光保存。用上述濃度為100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液分別稀釋成濃度為0.5、1、2、5、10、20 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中內(nèi)標(biāo)濃度均為10 ng/mL，待上機(jī)測(cè)定。

2.3.2 樣品前處理

稱(chēng)取豬肝2.00 g(精確至0.01 g，6平行樣品)于50 mL聚丙烯離心管，8 mL乙酸銨溶液，加入β-葡萄糖醛酸苷酶40 μL充分旋渦混勻，于37℃水浴酶解16 h，加入100 ng/mL混合內(nèi)標(biāo)100 μL，加入100 ng/mL混合標(biāo)液50 μL，旋渦混勻，高速冷凍(10000 r/min、4℃)離心10 min，將上清液全部轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管，加入0.1 mol/L高氯酸溶液5 mL，旋渦混勻，高速冷凍離心10 min，將上清液全部轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管，用10 mol/L氫氧化鈉調(diào)至pH9.3～9.7，加入15 mL乙酸乙酯，放于搖床振搖10 min，高速冷凍離心5 min，將上層有機(jī)相全部轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管，再在下層水相中加入10 mL叔丁基甲醚，放于搖床振搖10 min，高速冷凍離心5 min，合并有機(jī)相，在50℃氮?dú)庹舾?，加? mL 2%甲酸溶解，待凈化用。

將PCX固相萃取柱依次用3 mL甲醇，3 mL水，3 mL 2%甲酸溶液活化，分次倒入上述待凈化液5 mL過(guò)柱，再依次用2%甲酸溶液、甲醇各3 mL進(jìn)行淋洗，抽干，棄去淋洗液，用2.5 mL 3%氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，在45 ℃下用氮?dú)庹舾?，最后加? mL 0.1%甲酸溶液溶解，旋渦混勻1 min，過(guò)0.22 μL濾膜，待上機(jī)測(cè)定。

2.3.3 儀器測(cè)定條件

色譜條件：色譜柱為Agilent InfintyLab ProrsheLL 120 EC-C18(2.1×100mm 2.7um)；流動(dòng)相類(lèi)型：A相0.1%甲酸溶液，B相乙腈，A+B=98%+2%；梯度洗脫：0～2 min A98%，2～6 min A 98%～65%，6～7 min A 65%～20%，7～8.5 min A 20%～10%，8.5～9 min A 10%～98%；流速0.4 mL/min；運(yùn)行時(shí)間9 min，后運(yùn)行時(shí)間2 min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(AJS-ESI)；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；干燥氣溫度200 ℃，干燥氣流速14 L/min，鞘氣溫度350 ℃，鞘氣流速11 L/min。詳細(xì)質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 3種β受體激動(dòng)劑及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜參數(shù)

2.3.4 結(jié)果計(jì)算

計(jì)算公式：X=C×V/m。

3 結(jié)果分析

3.1 建立數(shù)學(xué)模型

根據(jù)測(cè)定方法和結(jié)果計(jì)算公式, 建立豬肝中3種β受體激動(dòng)劑殘留測(cè)定的數(shù)學(xué)模型，如式(1)所示。

(1)

式(1)中：X為豬肝樣品中被測(cè)物的含量，ug/kg；C為經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的豬肝樣品溶液中被測(cè)物的濃度，ng/mL；V為豬肝樣品溶液定容體積，mL；m為試樣的質(zhì)量，g；A為樣品溶液中被測(cè)物的峰面積；Ai為樣品溶液中被測(cè)物內(nèi)標(biāo)物的峰面積；k為線性回歸方程的斜率；b為回歸方程的截距；R為回收率。

3.2 分析不確定度的來(lái)源及量化

根據(jù)建立的數(shù)學(xué)模型，對(duì)檢測(cè)過(guò)程各種不確定度來(lái)源進(jìn)行分析如圖1所示，引入不確定度的主要來(lái)源有：被測(cè)藥物的濃度C，豬肝樣品的質(zhì)量m，測(cè)量?jī)x器的穩(wěn)定性，標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程，定容體積V，方法的重復(fù)性，回收率等。內(nèi)標(biāo)物在配制成100 ng/mL混合標(biāo)液之前其濃度保持一致，并不會(huì)對(duì)樣品中目標(biāo)物含量的測(cè)定造成影響，所以本文僅對(duì)100 ng/mL混合標(biāo)液分取使用過(guò)程引入的不確定度進(jìn)行分析。

圖1 不確定度來(lái)源

3.3 計(jì)算檢測(cè)過(guò)程各種不確定度

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

3.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品純度含量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(p)

沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品的純度p=99.90%，其擴(kuò)展不確定度為U=0.30%，取擴(kuò)展因子k=2，其引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為 urel(p沙) = 0.30%÷2÷99.90%=0.0015，urel(p克) =0.30%÷2÷97.08%=0.0016，urel(p萊)=0.71%÷2÷95.00%=0.0038。

3.3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)

3.3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液溶解及稀釋過(guò)程引入的相對(duì)不確定度

3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)不確定度

本實(shí)驗(yàn)對(duì)沙丁胺醇、克倫特羅、萊克多巴胺制備了6個(gè)不同濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)濃度點(diǎn)測(cè)定1次，以目標(biāo)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值(A/Ai)為縱坐標(biāo)，目標(biāo)物濃度與內(nèi)標(biāo)物濃度的比值(C/Ci)，為橫坐標(biāo)，采用最小二乘法擬合，各點(diǎn)權(quán)重均等，得出目標(biāo)物的回歸方程，詳見(jiàn)表2。

表2 3種β受體激動(dòng)劑的回歸方程

根據(jù)《JJF 1135-2005》[7]標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，見(jiàn)公式(2)

(2)

由上述計(jì)算過(guò)程計(jì)算得到的藥物的數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表3 線性擬合參數(shù)類(lèi)型

3.3.3 樣品稱(chēng)取引入的相對(duì)不確定度urel(m)

3.3.4 定容體積引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V)

3.3.5 檢測(cè)儀器引入的相對(duì)不確定度

本文所使用的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀的校準(zhǔn)證書(shū)上相對(duì)擴(kuò)展不確定度為Urel=11%，k=2。儀器的相對(duì)不確定度urel=11%÷2=0.055。

3.3.6 方法重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(rep)

表4 實(shí)驗(yàn)測(cè)定6次平行樣品的結(jié)果

3.4 計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

統(tǒng)計(jì)2.3.1至2.3.6過(guò)程中不確定度的各個(gè)來(lái)源，見(jiàn)表5。

表5 不確定度的來(lái)源統(tǒng)計(jì)

3.5 計(jì)算擴(kuò)展不確定度

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)表5，u(m)= urel(c)×mg，95%置信水平時(shí)，取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度U=k×u(m)，則最終沙丁胺醇的測(cè)量結(jié)果為X=2.49 ug/kg，U=0.48 g/kg，k=2；克倫特羅的測(cè)量結(jié)果為X=2.52 ug/kg，U=0.56 g/kg，k=2；萊克多巴胺的測(cè)量結(jié)果為X=2.52 ug/kg，U=0.56 g/kg，k=2。

4 結(jié)論

本文評(píng)定不確定度影響因素量序大小見(jiàn)表5，結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)中不確定度主要來(lái)自于檢測(cè)儀器的誤差、標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液配制、曲線擬合情況和方法的重復(fù)性，與其次是樣品的稱(chēng)量、儲(chǔ)備液配制和最終定容體積。本文所評(píng)定的不確定度主要來(lái)源與同行[8-11]評(píng)定結(jié)果基本一致，證明本文的評(píng)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境20±5 ℃，器皿校準(zhǔn)時(shí)溫度與實(shí)時(shí)溫度差異、甲醇等溶劑的膨脹系數(shù)所引入的不確定度遠(yuǎn)小于本文所評(píng)定的7項(xiàng)，故本文忽略溫度因素。由本實(shí)驗(yàn)中引入不確定度的主要來(lái)源進(jìn)行整改措施，降低整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中可能產(chǎn)生的不確定度，減小檢測(cè)結(jié)果的誤差。改進(jìn)措施：1、本實(shí)驗(yàn)曲線配制過(guò)程引入的不確定度主要是多次使用誤差較大的50 uL、100 uL移液槍檢，應(yīng)改為在配制工作曲線時(shí)直接從100 ng/mL混合標(biāo)液中吸取到10 mL容量瓶中定容，減少小體積移液槍的使用次數(shù)。2、測(cè)量?jī)x器狀態(tài)不佳帶來(lái)較大測(cè)定誤差，建議增加日常儀器的維護(hù)頻率，對(duì)儀器進(jìn)行定期校準(zhǔn)及期間核查等工作，必要時(shí)請(qǐng)專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行維修維護(hù)，使儀器的穩(wěn)定性達(dá)到最佳狀態(tài)。3、本文中3種β受體激動(dòng)劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2>0.996，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)其最大濃度點(diǎn)20 ng/mL的峰面積接近線性拐點(diǎn)，舍去該點(diǎn)后線性可達(dá)到0.999以上。建議將標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍改為0.5～10 ng/mL之間，同時(shí)內(nèi)標(biāo)液濃度改為5 ng/mL。4、加強(qiáng)檢測(cè)技術(shù)人員培訓(xùn)，規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作，減少人為因素、操作失誤等引入的不確定度。