林小貞，周婉儀，賈曉菲，何思聰，招鈺娟，譚淑鏵

(中山市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)所，廣東 中山 528437)

1 引言

氟喹諾酮類(Fluoroquinolones，F(xiàn)QNs)藥物屬第三代喹諾酮類抗菌藥，其抗菌譜進(jìn)一步擴(kuò)大，抗菌活性更強(qiáng)，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌如金色葡萄球菌、鏈球菌及革蘭氏陰性菌等有效，也是獸醫(yī)臨床中廣泛應(yīng)用的抗革蘭氏陽(yáng)性菌與陰性菌及霉形體的有效抗菌藥。氟喹諾酮類藥物通過(guò)抑制細(xì)菌DNA的合成來(lái)殺滅細(xì)菌，屬于殺菌劑，在臨床上應(yīng)用廣泛，用于治療各種細(xì)菌感染，還用于治療支原體、衣原體感染和結(jié)核病。因?yàn)槠渚哂锌咕V廣、抗菌作用強(qiáng)、體內(nèi)分布廣、在體內(nèi)藥物濃度高、蛋白結(jié)合率低、血半衰期長(zhǎng)、使用方便、療效良好、藥物不良反應(yīng)輕微及價(jià)格便宜等特點(diǎn)[1]，在獸醫(yī)臨床和畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖中被大量應(yīng)用。

現(xiàn)在市面上的雞、鴨、鵝等畜禽產(chǎn)品基本都是來(lái)源于養(yǎng)殖場(chǎng)，養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，在這樣的背景下，很多動(dòng)物的疾病逐漸涌現(xiàn)出來(lái)，漸漸的衍生出了含有各類抗菌藥物的飼料。動(dòng)物在食用了這類飼料后，治療好疾病的同時(shí)也在體內(nèi)產(chǎn)生了大量的藥物殘留，這對(duì)人類健康和環(huán)境污染都有一定的影響。

目前，測(cè)定FQNs的方法有酶聯(lián)免疫法[2]、微生物法[3]、高效液相色譜法[4，5]、高效毛細(xì)管電泳法[6]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7～9]等。其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能使多種藥物在色譜柱上都有很好的分離效果，因此近年來(lái)，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在獸藥殘留的檢測(cè)分析中被廣泛應(yīng)用。本方法建立了一種使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀同時(shí)測(cè)定飼料中16種氟喹諾酮類藥物的方法，為飼料中的獸物殘留檢測(cè)方法提供參考。

2 材料與方法

2.1 儀器、試劑與實(shí)驗(yàn)樣品

(1)儀器：Agilent G6495三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司)，配Agilent 1290高效液相色譜儀；Poroshell 120 EC-C18色譜柱(2.1×100 mm，2.7 μm，美國(guó)Agilent公司)；渦旋振蕩器(德國(guó)IKA公司)；高速離心機(jī)(3-18KS，德國(guó)Sigma公司)；干式氮吹儀(HGC-24A，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)；超聲清洗儀；電子天平；除脂分散凈化管(15 mL，安捷倫)；鹽析包(4 g無(wú)水硫酸鈉+1 g氯化鈉)；微孔濾膜(0.22 μm)；水為一級(jí)用水等。

(2)試劑：吡哌酸、麻保沙星、氧氟沙星、培氟沙星、依諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、單諾沙星、洛美沙星、二氟沙星、沙拉沙星、西諾沙星、奧索利酸、萘啶酸、氟甲喹等標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；甲酸(色譜純)；乙腈(色譜純)；甲醇(色譜純)；乙酸乙酯(色譜純)；磷酸氫二鈉(AR500 g)；檸檬酸(AR500 g)；乙二胺四乙酸二鈉(AR500 g)。

EDTA-Macllvaine緩沖溶液(0.1 mol/L，將625 mL 0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液與1000 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液混合，再稱取60.5 g乙二胺四乙酸二鈉溶解)

(3)樣品：雞配合飼料，攪拌機(jī)粉碎處理，置于通風(fēng)干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取16種氟喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，置于容量瓶中，用甲醇溶解定容，配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋，配成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各組分為1 μg/mL。

由于飼料樣品的基質(zhì)較為復(fù)雜，基質(zhì)會(huì)對(duì)所檢測(cè)的目標(biāo)化合物存在一定的干擾，所以使用空白基質(zhì)添加作標(biāo)準(zhǔn)系列曲線，其濃度為2、5、10、20、50、100 ng/mL。

2.3 樣品前處理

稱取樣品2.00 g于50 mL塑料離心管中，加入2 mL EDTA-Macllvaine緩沖溶液，渦旋30 s，再加入10 mL 1.5%甲酸乙腈，渦旋1 min，超聲提取10 min后，10000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至已活化(加入3 mL水活化)的除脂分散凈化管中，渦旋1 min，10000 r/min離心5 min，將上清液全轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入鹽析包，振蕩5 min，10000 r/min離心5 min，取2 mL上清液于試管中，于40 ℃下氮?dú)獯蹈?。? mL初始流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋震蕩，過(guò)0.45 μm濾膜后，上機(jī)檢測(cè)。

2.4 儀器檢測(cè)方法

2.4.1 液相色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18 2.1×100 mm，2.7 μm；柱溫40 ℃；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量1.00 μL；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.1%甲酸水；流動(dòng)相梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 分離16種氟喹諾酮藥物的洗脫梯度

2.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(AJS ESI)，正離子模式掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，離子溫度：350 ℃；干燥氣流速14 L/min；霧化器壓力30 psi；鞘氣溫度350 ℃；鞘氣流速11 L/min。16種氟喹諾酮藥物的詳細(xì)質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2，總離子流圖見(jiàn)圖1。

3 結(jié)果與分析

3.1 樣品前處理提取方法的優(yōu)化

飼料的原料來(lái)源比較多，包擴(kuò)大豆、玉米、豆粕、魚粉、雜粕、氨基酸、乳清粉、肉骨粉、油脂、谷物、飼料添加劑等十余個(gè)品種的飼料原料，因此在檢測(cè)獸藥殘留的過(guò)程中，干擾物質(zhì)較多，所以選擇一種比較好的提取液尤為重要，本實(shí)驗(yàn)分別比較了1.5%甲酸的乙腈溶液、乙酸乙酯、1%甲酸甲醇3種提取液，圖2為3種提取液的回收率比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1.5%乙酸的乙腈溶液提取效果較好。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別在正、負(fù)離子模式下對(duì)16種氟喹諾酮類藥物進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)在正離子模式下響應(yīng)強(qiáng)度更強(qiáng)。在甲醇-0.1%甲酸水溶液(80∶20，V∶V)等度流動(dòng)相條件下，采用MassHunter Optimizer(自動(dòng)參數(shù)優(yōu)化軟件)進(jìn)行優(yōu)化，確定母離子和子離子，優(yōu)化CE電壓。

3.3 色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)待測(cè)化合物的峰型和響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)表明在以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)各種藥物的峰型優(yōu)于另外兩種流動(dòng)相條件，且響應(yīng)值也略高于其他兩種流動(dòng)相下的響應(yīng)值，因此，本實(shí)驗(yàn)采用甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

表2 16種氟喹諾酮藥物殘留測(cè)定的值質(zhì)譜測(cè)定條件參數(shù)

3.4 方法學(xué)驗(yàn)證

3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

方法采用空白基質(zhì)添加的方法作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其濃度為2、5、10、20、50、100 ng/mL，通過(guò)定量軟件分析得出16種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線與其線性回歸方程(表3)。結(jié)果表明，16種氟喹諾酮類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線有較好的線性關(guān)系。樣品的檢出限以3倍信噪比計(jì)算，得到16種化合物的檢出限范圍為0.035～1.127 μg/kg，滿足國(guó)內(nèi)和國(guó)際對(duì)氟喹諾酮類藥物殘留監(jiān)控的要求。

3.4.2 回收率和精密度

為確保方法的可行性，對(duì)空白飼料進(jìn)行3個(gè)濃度水平的添加，并且分別做6個(gè)平行樣品，同時(shí)做空白對(duì)照，分析結(jié)果見(jiàn)表4。

3.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

隨機(jī)抽取5間飼料店面的飼料樣品，采用本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行16種氟喹諾酮類藥物含量的測(cè)定，結(jié)果均未檢出?？紤]在實(shí)際生產(chǎn)中，一般在投喂前才在飼料中加入各種藥物添加劑，而飼料樣品抽取的是未開(kāi)封的包裝飼料，所以在這個(gè)環(huán)節(jié)中存在一定的監(jiān)控風(fēng)險(xiǎn)。

注：1.吡哌酸；2.麻保沙星；3.氧氟沙星；4.培氟沙星；5.依諾沙星；6.諾氟沙星；7.環(huán)丙沙星；8.恩諾沙星；9.單諾沙星；10.洛美沙星；11.二氟沙星；12.沙拉沙星；13.西諾沙星；14.奧索利酸；15.萘啶酸；16.氟甲喹

圖1 16種氟喹諾酮藥物的總離子流

圖2 3種提取液的回收率比較

表3 16種氟喹諾酮藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)與檢出限

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中16種氟喹諾酮類藥物殘留的方法。方法操作簡(jiǎn)單，快速可靠、靈敏度高、重現(xiàn)性好，滿足獸藥殘留檢測(cè)分析的要求，適用于飼料中氟喹諾酮類藥物的殘留檢測(cè)。

表4 飼料中16種氟喹諾酮藥物的平均加標(biāo)回收率與精密度

續(xù)表4