胡國君，張尊平，范旭東，任 芳，馬勉娣，張秀英，魯興凱，董雅鳳

（1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，國家落葉果樹脫毒中心，遼寧興城 125100）（2 昭通市蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心）

花葉病是蘋果上的一類重要病毒病害，發(fā)生普遍，危害嚴(yán)重，典型癥狀為葉片上形成大小不一的鮮黃色或黃白色斑塊。發(fā)病后蘋果葉片葉綠素總量可降低14.80%～38.72%、凈光合速率降低 2.93%～45.83%，果實(shí)減產(chǎn)30%～50%[1-2]。20 世紀(jì)30 年代該病害在歐洲首次報道[3]，其病原為蘋果花葉病毒（apple mosaic virus，ApMV），我國最早的文獻(xiàn)記載在20 世紀(jì)50 年代末[4]。目前，我國關(guān)于該病害的研究主要集中在癥狀觀察及發(fā)生情況調(diào)查等方面，深入研究較少，根本原因是作為病原的ApMV 在我國檢測比較困難[5]。2017 年，日本學(xué)者在從我國引進(jìn)的表現(xiàn)花葉癥狀的蘋果樹上檢測到1 種雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）等軸不穩(wěn)環(huán)斑病毒屬（Ilarvirus）的新病毒，并命名為蘋果壞死花葉病毒（apple necrotic mosaic virus，ApNMV）[6]。經(jīng)進(jìn)一步研究確認(rèn)，ApNMV 為我國蘋果花葉病的主要病原[7]，在韓國和印度的蘋果樹上也發(fā)現(xiàn)了該病毒[8-9]。據(jù)報道，山楂也是ApNMV 的寄主[10]。ApNMV 為正義單鏈RNA 病毒，由3 條鏈組成（RNA1、RNA2和RNA3）。RNA1 和RNA2 編碼2 個聚合蛋白，與病毒的復(fù)制相關(guān)；RNA3 編碼運(yùn)動蛋白和外殼蛋白，分別位于基因組的5′和3′端[6]。

目前，蘋果病毒主要以核酸檢測為主，如常規(guī)PCR、巢式PCR、多重PCR 和實(shí)時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）等。其中，qPCR作為一種靈敏度高、特異性和可靠性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的檢測技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于果樹病毒檢測[11-13]。由于qPCR 是在封閉的環(huán)境下進(jìn)行反應(yīng)，通過收集熒光信號來判斷反應(yīng)結(jié)果，與巢式PCR 等同樣靈敏度較高的檢測方法相比，具有數(shù)據(jù)讀取簡單、不易產(chǎn)生污染等優(yōu)點(diǎn)。邢飛[14]建立了 ApNMV 一步RT-qPCR 探針檢測方法。本研究建立了一種ApNMV 的TB Green 染料法qPCR 檢測方法，可對田間不同生長周期不同組織部位的蘋果樣品進(jìn)行檢測，有效提高了ApNMV 的檢測效率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以實(shí)驗(yàn)室保存的8 株攜帶ApNMV 的蘋果樹作為qPCR 引物篩選的測試樣品，其中，‘富士’和‘響富’各2 株，‘華紅’‘天宏’‘嘎拉’、晉18 各1 株，以無毒砧木組培苗‘B9’為陰性對照。其余檢測樣品均采集于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所的試驗(yàn)田。

1.2 試劑及儀器耗材

Taq?酶、10×PCR Buffer（Mg2+plus）、dNTPs、PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser Perfect Real Time、TB Green?Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）和大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司（TaKaRa）；膠回收試劑盒購自愛思進(jìn)公司（Axygen）；pTOPO-TA Vector 購自北京艾德萊生物科技有限公司；qPCR用耗材Optical Flat 8-Cap Strips for 0.2 mL tube strips/plates 和Low-Profile PCR Tubes 8-tube strip（white）、儀器CFX Connect? Real-Time System，購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司（Bio-Rad）；反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 購自普洛麥格公司（Promega）；DNA Mark II 購自北京天根生化科技有限公司；DNase/RNase Free dH2O 購自生工生物工程（上海）股份有限公司；超微量紫外可見分光光度計(jì)（DS-11）購自美國丹諾爾公司（Denovix）。

1.3 總RNA 提取及cDNA 合成

取蘋果枝條韌皮部或葉片樣品50 mg，采用吸附柱法[15]進(jìn)行總RNA 提取，利用超微量紫外可見分光光度計(jì)（DS-11）進(jìn)行總RNA 濃度測定及質(zhì)量分析，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用去除基因組DNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser Perfect Real Time，Takara）合成cDNA：取5×gDNA Eraser buffer 2.0 μL、gDNA Eraser 1.0 μL 及總 RNA 1 μg，加RNase Free ddH2O 至總體積為10 μL，混勻，42.0 ℃ 2 min，放冰上。然后加入含PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1.0 μL、RT Primer Mix 1.0 μL、5×PrimeScript buffer 2 4.0 μL 和RNase Free ddH2O 4.0 μL 的混合液，混勻，37 ℃ 15 min，85 ℃5 s，產(chǎn)物在冰上冷卻后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)、鑒定及篩選

分別根據(jù)GenBank已登錄的ApNMV 3條RNA鏈上的保守序列，設(shè)計(jì)了12 對ApNMV qPCR 檢測引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

采用常規(guī)PCR 對引物的特異性進(jìn)行篩選。反應(yīng)體系為25 μL，含10×PCR buffer（Mg2+plus）2.5 μL、dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）0.5 μL、10 μmol/L正向、反向引物各0.5 μL、5 U/μL rTaq? 0.125 μL和 cDNA 2 μL，用dH2O 補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

采用qPCR 對引物的檢測效果進(jìn)行篩選。反應(yīng)體系為20 μL，含TB GreenPremix Ex TaqII（Tli RNaseH Plus）（2X）10.0 μL、10 μmol/L 正、反向引物各0.5 μL、DNase/RNase Free dH2O 7 μL 和cDNA 2 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性32 min，94 ℃10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，40 個循環(huán)，延伸結(jié)束時記錄熒光信號。熔解曲線分析的溫度范圍是60～95 ℃，每5 s 增加0.5 ℃，以鑒別引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后與 pTOPO-TA Vector 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α。挑取白色菌落進(jìn)行PCR 鑒定，將陽性克隆送北京諾賽基因組研究中心有限公司測序。將獲得的序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性分析。

以‘華紅’樣品100～10-7梯度稀釋的cDNA 為模板，構(gòu)建qPCR 各引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 ApNMV 實(shí)時熒光定量PCR 引物

1.5 qPCR 擴(kuò)增條件的優(yōu)化

將感染ApNMV 的‘華紅’樣品總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 作為模板，分別采用終濃度為200、300、400、500 nmol/L 的引物進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增，根據(jù)Cq值和擴(kuò)增效果篩選出每對引物的最佳濃度。在最佳引物濃度下，檢測不同引物在退火溫度分別為52.0、54.0、55.9、58.4、60.3、62.0 ℃時熒光信號的變化情況，選取擴(kuò)增效果最好時的退火溫度。

1.6 qPCR 檢測的靈敏度

以‘華紅’樣品100～10-7梯度稀釋的cDNA 為模板，分別進(jìn)行qPCR 和常規(guī)PCR 擴(kuò)增，比較不同方法的靈敏度。

1.7 田間樣品檢測

2019 年12 月至2020 年1 月在田間從休眠蘋果枝條上采集60 個樣品（9 個樣品葉片在夏季表現(xiàn)花葉的癥狀），分別采用常規(guī)PCR 和qPCR 檢測ApNMV，比較2 種方法的檢測效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物的篩選及鑒定

以無毒砧木‘B9’試管苗為陰性對照，選取8個ApNMV 陽性蘋果樣品進(jìn)行常規(guī)PCR 檢測。12對引物在所有陽性樣品中均擴(kuò)增到目標(biāo)片段大小的條帶（圖1），陰性對照和未加模板的空白對照未擴(kuò)增到條帶，但引物ApN2-F3/R3、ApN1-CP-F1/R1和ApN1-CP-F2/R2 的擴(kuò)增產(chǎn)物不是單一條帶，有雜帶，引物ApN1-F2/R2 的二聚體比較明顯，引物利用率低?；厥掌溆? 對引物擴(kuò)增‘華紅’蘋果樣品的PCR 產(chǎn)物，進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化并送測序。將所獲得的序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行Blast 分析，結(jié)果顯示，ApN1-MP-F2/R2 的擴(kuò)增序列不是ApNMV 序列，其余7 對引物的擴(kuò)增序列均為ApNMV 特異序列，與GenBank 中已登錄的ApNMV 分離物的核苷酸序列同源性為93.6%～98.8%。

圖1 7 對ApNMV 引物常規(guī)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖

選取ApNMV 陽性蘋果樣品‘華紅’和‘響富’及陰性蘋果樣品‘B9’進(jìn)行qPCR 檢測。提取的3個樣品的總RNA 濃度分別為420.86、441.59、407.73 ng/L，3 對引物對3 個樣品的擴(kuò)增曲線Cq值分別為ApN1-F3/R3（18.90、18.53 和34.49）、ApN2-F1/R1（17.42、17.61 和34.93）和ApN3-MP-F3/R3（17.59、17.48 和34.79）。內(nèi)參引物EF-1α-F/R 對2 個樣品的擴(kuò)增曲線Cq值分別為15.36 和15.16，且熔解曲線為單一峰。

以‘華紅’樣品100～10-7梯度稀釋的cDNA 為模板，分別構(gòu)建3 對ApNMV 特異引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表2 可知，引物ApN1-F3/R3 的擴(kuò)增效率最高。

表2 各ApNMV 引物標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴(kuò)增效率、相關(guān)系數(shù)、斜率、截距

2.2 qPCR 反應(yīng)體系優(yōu)化

在52.0～62.0 ℃間設(shè)置了6 個退火溫度，qPCR擴(kuò)增Cq值為17.35～17.62，不同溫度間的Cq值差異不明顯，僅為0.27，當(dāng)退火溫度為60.3 ℃時，相對熒光強(qiáng)度相對較強(qiáng)，且熔解曲線為單一峰，作為最佳退火溫度（圖2-A）。在60.3 ℃下，4 個引物濃度間的Cq值為17.03～18.12，不同濃度間的Cq值差異較大，其中引物濃度為300 nmol/L 時，與其他3 個濃度區(qū)分明顯，Cq值最小，為17.03（圖2-B），因此，將300 nmol/L 作為最終引物濃度。

圖2 不同退火溫度（A）和引物濃度（B）下ApNMV 的qPCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.3 qPCR 檢測的靈敏度

qPCR 和常規(guī)PCR 檢測靈敏度測試結(jié)果表明，常規(guī)PCR 能檢測到稀釋倍數(shù)為10-3的ApNMV 陽性蘋果樣品的cDNA（圖3-A），而qPCR 可檢測稀釋倍數(shù)為10-5的ApNMV 陽性蘋果樣品的cDNA，此時Cq值為33.78，仍小于陰性對照的Cq值（34.49），qPCR 檢測靈敏度比常規(guī)PCR 檢測提高了100 倍（圖3-B）。

圖3 不同稀釋梯度蘋果樣品常規(guī) PCR（A）和qPCR（B）檢測靈敏度比較

2.4 田間樣品檢測

應(yīng)用常規(guī)PCR 和所建立的qPCR 方法對60 個蘋果樣品進(jìn)行ApNMV 檢測，檢測部位為枝條韌皮部，常規(guī)PCR 的檢出率為51.7%，qPCR 的檢出率為56.7%。2 種方法在9 個有花葉癥狀的蘋果樣品中均檢測到ApNMV；在未表現(xiàn)癥狀的蘋果樣品中，qPCR 檢測到ApNMV 的數(shù)量比常規(guī)PCR 多檢測到3個。

3 結(jié)論與討論

病毒病已然成為危害我國蘋果產(chǎn)業(yè)的重要病害，按癥狀表現(xiàn)可分為潛隱性和非潛隱性病害2 大類型?；ㄈ~病是重要的顯癥病毒病害，在我國各個蘋果產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生[7,17]。病毒病不能通過化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，栽植無病毒苗木是最有效的防控措施，而建立靈敏、可靠、快速的病毒檢測技術(shù)可為病毒病防控提供重要的技術(shù)保障，同時對蘋果苗木和種質(zhì)資源的認(rèn)證及檢疫工作也具有重要意義。受病原的限制，我國對蘋果花葉病的檢測技術(shù)研究還比較少。

本研究針對已報道的ApNMV 分離物3 條RNA鏈的保守區(qū)域設(shè)計(jì)12 對引物，分別進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增和目標(biāo)片段的克隆測序，通過擴(kuò)增效果比較及序列比對分析，確定7 對ApNMV 特異引物；進(jìn)一步比較7 對引物對2 個陽性樣品擴(kuò)增曲線的Cq值，分別從3 條鏈上各篩選出1 對可用于qPCR 檢測引物；最后通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得3 對引物的擴(kuò)增效率，確定引物ApN1-F3/R3 用于ApNMV 的qPCR分析。通過引物濃度和退火溫度的優(yōu)化，建立了以ApN1-F3/R3 為引物的qPCR 檢測方法，可特異性檢測ApNMV，大大提高了檢測效率，靈敏度是常規(guī)PCR 檢測的100 倍。該檢測方法適用范圍廣，對不同生長時期和不同部位的蘋果樣品均有良好的檢測效果。

引物的特異性、病毒在樣品中的含量和取樣時間是影響以核酸為基礎(chǔ)的病毒檢測方法的關(guān)鍵因素[18]。此外，病毒群體的遺傳多樣性也影響檢測效率，病毒基因組高度變異可直接導(dǎo)致檢測失敗或假陰性出現(xiàn)[12]。與其他方法相比，qPCR 無需電泳凝膠和染色，節(jié)省了病毒檢測的時間，并具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、病毒可以被量化等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足針對各種類型的植物樣品中ApNMV 的檢測和帶毒量測定。本研究為蘋果脫毒苗提供了有效的認(rèn)證檢測方法，也為ApNMV 的流行監(jiān)測與種群生態(tài)學(xué)研究提供了支撐。