邊超 姜海燕 張慧敏 李智軍

(內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 1.放射治療科；2.畢業(yè)后醫(yī)學教育辦公室，內(nèi)蒙古 呼和浩特010017)

食管癌在我國惡性腫瘤中發(fā)病率排名第三，死亡率排名第四，嚴重威脅患者的生命健康[1]。目前手術與放化療相結合的綜合治療是食管癌患者的主要治療策略，雖然隨著醫(yī)療技術的提高，治療策略取得了顯著的進展，但是食管癌患者的預后仍然不盡人意，其5年生存率仍較低[2]。研究報道放療抵抗是食管癌患者預后不良的主要原因[3]。因此研究食管癌放療抵抗的分子機制，增加腫瘤對放療的敏感性是改善患者臨床癥狀的重要策略。異位病毒整合位點1(ecotropic viral integration siECA109, EVI1)是一個雙域鋅指轉錄因子，在調(diào)節(jié)造血干細胞更新和骨髓祖細胞分化中起著重要作用，其異常表達可導致骨髓增生異常綜合征和急性髓細胞性白血病等造血源性惡性腫瘤[4-6]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)EVI1與實體瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，包括膠質(zhì)母細胞瘤和卵巢癌等惡性腫瘤[7-9]。研究報道EVI1與腫瘤治療抵抗相關，在鼻咽癌中EVI1的表達上調(diào)促進腫瘤細胞的放化療抵抗[10]，但EVI1在食管癌中的相關研究鮮有報道，因此本文對此進行了相關研究，旨在獲得EVI1作為增加食管癌細胞放射敏感性的潛在分子靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑材料 Trizol試劑購自美國Sigma公司，ULtraRT one step RT-PCR Kit試劑盒購自北京百奧萊博生物技術有限公司，EVI1和GAPDH引物購自上海生工生物工程有限公司，胎牛血清、基礎培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自美國Gibco公司，食管癌細胞系ECA109購自美國ATCC細胞庫，RIPA裂解液和BCA檢測蛋白濃度試劑盒購自美國Thermo公司，PVDF膜和ECL化學發(fā)光試劑盒購自美國millipore公司，EVI1 siRNA購自中國上海吉凱基因試劑有限公司，MTS試劑購自美國GlpBio公司，吉姆薩染液購自上海碧云天生物技術有限公司，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術有限公司，EVI1抗體、活化caspase 3、Bcl-2和Bax抗體購自英國Abcam公司。

1.2 臨床樣本 選擇2017年1月～2019年2月在我院診治的食管癌患者，納入中晚期不適合手術治療而進行放射治療的初次治療的食管癌病例67例，其中男性患者38例，女性患者29例；年齡≤55歲21例，>55歲46例；放療敏感型患者42例，放療抵抗型患者25例；中高分化35例，低分化32例；淋巴結轉移45例，無淋巴結轉移22例；Ⅲ期31例，Ⅳ期36例?；颊叻暖煼桨敢? Gy/f為參考劑量，總劑量為50～60 Gy/20～30 f，并根據(jù)CT掃描結果進行療效評定。納入研究的患者均簽署知情同意書，并由我院倫理委員會審核通過。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR檢測 經(jīng)纖維食管鏡獲得放射治療前的食管癌活檢組織，新鮮食管癌組織經(jīng)Trizol試劑裂解，以氯仿和異丙醇方法提取組織中RNA。采用ULtraRT one step RT-PCR Kit試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，并以其為模板進行PCR擴增，反應體系及條件為：2X ULtraRT one step Buffer 12.5 μL、RNA 1 μg、上下游引物各1 μL、ULtraRT one step EnzymeMix 0.5 μL和無RNA酶的雙蒸水補足25 μL，45 ℃逆轉錄30 min、PCR預變性95 ℃ 2 min(變性94 ℃ 30 s，退火65 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共40個循環(huán))，終延伸72 ℃ 5 min進行qRT-PCR擴增反應。EVI1引物F：5′-GATTGCAGAACCCAAGTCAAGT-3′，R：5′-CTATTGGCGCCAAAATAGTCAG-3′；GAPDH引物F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，R：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。以GAPDH為內(nèi)參按照2-ΔΔCt公式計算EVI1 mRNA的相對表達量。

1.3.2 細胞培養(yǎng) 食管癌細胞系ECA109從液氮取出后放入37 ℃水浴鍋中快速復蘇，800 r/min離心3 min后重懸至含有10%的胎牛血清細胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2的全濕度培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基顏色變色時更換新鮮培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察，細胞長滿時胰酶消化進行細胞傳代。

1.3.3 ECA109R細胞的構建 將ECA109細胞分次遞增輻射，2 Gy劑量輻射3次，4 Gy劑量輻射3次，6 Gy劑量輻射3次和8Gy劑量輻射3次，總計60 Gy。輻射3個左右，輻射后存活的細胞形成細胞克隆。 將克隆胰酶消化后擴大培養(yǎng)，采用MTS檢測ECA109R細胞放射IC50值，鑒定細胞放療抵抗性。ECA109和ECA109R細胞以每孔3000個細胞接種至96孔板中，每組包含6個重復孔，接種12 h后分別進行不同劑量的放射處理(0、1、2、4、8、16、32和64Gy)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入20μL的MTS試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2 h，在490 nm處測得細胞的吸光度(OD值)。細胞存活率=(放射處理組平均OD值/Gy組平均OD值)×100%。計算細胞存活率為50%時所對應的放射劑量(IC50)。

1.3.4 Western blotting檢測 刮刀收集細胞，離心后獲得細胞斑塊，加入RIPA蛋白裂解液，超聲裂解20 min，4 ℃高速離心30 min，獲得細胞總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒說明書測得蛋白濃度，蛋白放置沸水中沸煮5 min進行蛋白變性，凝膠電泳(SDS-PAGE)進行樣品的蛋白分離，采用電濕轉方式將蛋白轉移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫孵育1 h，目的一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，化學發(fā)光法曝光蛋白條帶。

1.3.5 細胞轉染 ECA109R細胞呈對數(shù)生長期時，胰酶消化收集細胞，并以2×105個細胞接種至6孔板中，分為對照組(si-NC組)和干擾EVI1表達組(si-EVI1組)，12 h后采用脂質(zhì)體2000與siRNA混合后進行轉染，NC組轉染對照siRNA，si-EVI1組轉染EVI1 siRNA，8 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。采用western blotting檢測各組細胞中EVI1蛋白的表達。

1.3.6 MTS實驗檢測細胞存活率 ECA109R細胞呈對數(shù)生長期時，胰酶消化收集細胞，并以3000個細胞接種至96孔板中，每組設置6個重復孔，細胞轉染后分別進行不同劑量的放射處理(0、1、2、4、8、16、32和64Gy)，在培養(yǎng)48 h后，更換100 μL新鮮培養(yǎng)基，加入20 μL的MTS試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2 h，在490 nm處測得細胞的吸光度(OD值)。細胞存活率=(si-EVI1組平均OD值/si-NC組平均OD值)×100%。

1.3.7 平板克隆實驗檢測克隆形成率 ECA109R細胞呈對數(shù)生長期時，胰酶消化收集細胞，并以500個細胞接種至6孔板中，每組設置3個重復孔，細胞轉染后按照ECA109R的放射IC50劑量進行輻射。轉染后放在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d左右，肉眼可觀察到細胞克隆團形成，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗兩次，加入甲醇溶液固定細胞10 min，棄掉甲醇，加入吉姆薩染液染色10 min，雙蒸水洗3洗，晾干后進行細胞克隆計數(shù)，細胞克隆形成率=(si-EVI1組平均克隆形成數(shù)目/si-NC組平均克隆形成數(shù)目)×100%。

1.3.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 采用無EDTA的胰酶消化收集轉染siRNA 48 h和經(jīng)ECA109R放射IC50劑量照射的各組細胞，PBS洗3次后計數(shù)，每管1×106個，每組設置3個重復管。按照Annexin V-FITC/PI染色試劑盒說明書，細胞加入500 μL染色緩沖液重懸后，加入5 μL的Annexin V-FITC 和5 μL PI染色液混勻，常溫孵育10 min，流式細胞儀上機檢測細胞凋亡率，并計數(shù)各組細胞平均凋亡率。

2 結果

2.1 qRT-PCR檢測EVI1在食管癌組織中的表達及臨床意義 EVI1在低分化組織、臨床分期晚期和放療抵抗食管癌組織中的表達分別高于在中高分化組織、臨床分期早期和放療敏感的食管癌組織中的表達(P<0.05)。結果表明EVI1的表達與食管癌患者放療敏感性、分化程度和臨床分期相關，見表1。

表1 EVI1表達與食管癌患者臨床病理參數(shù)之間的關系

2.2 EVI1的表達與食管癌放療敏感性的相關性 根據(jù)EVI1在食管癌組織中的表達水平將EVI1的表達分為EVI1高表達組(>3.98，38例)和EVI1低表達組(≤3.98，29例)，采用Spearman等級相關分析顯示EVI1的表達與食管癌患者放療敏感性呈負相關(r=-0.574，P=0.031)。

2.3 放射抵抗型細胞株ECA109的構建 在相同放射劑量處理下，ECA109細胞的存活率顯著低于ECA109R細胞的存活率(P<0.05)，ECA109細胞的放射IC50劑量為(7.14±1.09)，ECA109R細胞的放射IC50劑量為(10.32±0.85)。與ECA109細胞相比，ECA109R細胞的放射IC50劑量增加(P<0.05)，見表2。

表2 不同放射劑量對ECA109和ECA109R細胞存活率的影響

2.4 EVI1在ECA109R中的表達 western blotting檢測結果顯示，EVI1在ECA109細胞中的相對表達量為0.35±0.12，在ECA109R細胞中的相對表達量為0.97±0.20，與放射敏感性細胞ECA109相比，EVI1在放射抵抗性細胞ECA109R中的表達增加(t=4.604，P=0.006)，見圖1。

圖1 EVI1在放射抵抗性食管癌細胞ECA109R中的表達

2.5 EVI1 siRNA的干擾效果 EVI1在si-NC組細胞中EVI1的表達量為1.08±0.26，在si-EVI1組細胞中的表達量為0.39±0.15，與si-NC組相比，si-EVI1組細胞中EVI1的表達降低(t=3.982,P=0.011)，見圖2。

2.6 EVI1siRNA對ECA109R細胞放療敏感性的影響 在相同放射劑量處理下，si-EVI1組細胞存活率顯著低于si-NC組細胞存活率(P<0.05)，si-NC組細胞的放射IC50劑量為10.03±2.04，si-EVI1組細胞的放射IC50劑量為8.57±1.02，與si-NC組相比，si-EVI1組細胞的放射IC50劑量降低(P<0.05)，見表3。

圖2 western blotting檢測EVI1 siRNA干擾效果

表3 EVI1siRNA對ECA109R細胞放療敏感性的影響

2.7 EVI1siRNA對放療處理的ECA109R細胞克隆形成率影響 si-NC組細胞克隆形成率為(100.00±1.00)%，si-EVI1組細胞克隆形成率為(29.93±4.40)%，與si-NC組相比，si-EVI1組細胞的克隆形成率降低(t=28.440,P<0.001)，見圖3。

2.8 EVI1siRNA對放療處理的ECA109R細胞凋亡率影響 si-NC組細胞凋亡率為3.68±0.47，si-EVI1組細胞凋亡率為31.95±2.40，與si-NC組相比，si-EVI1組細胞的凋亡率顯著增加(t=20.030,P<0.001)，見圖4。

2.9 EVI1siRNA對放療處理的ECA109R細胞相關蛋白影響 與si-NC組相比，si-EVI1組細胞中活化caspase 3和Bax蛋白的表達均增加，Bcl-2蛋白表達降低(P<0.015)，見圖5和表4。

3 討論

食管癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，據(jù)估計，我國每年超過45萬例食管癌新發(fā)病例。食管癌的發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)變化很大，在亞洲中具有高發(fā)病率，每年約有一半新診斷的食道癌病例發(fā)生在中國，尤其是在中國中北部地區(qū)和潮汕地區(qū)[11-12]。

圖3 EVI1siRNA對放療處理的ECA109R細胞克隆形成率的影響

圖4 EVI1siRNA對放療處理的ECA109R細胞凋亡率的影響

圖5 EVI1siRNA對放療處理的ECA109R細胞凋亡相關蛋白的影響

表4 各組細胞中凋亡相關蛋白的相對表達量

這可能和食管癌的發(fā)病危險因素相關，在西方國家食管癌主要是由吸煙引起的[13]，在我國食用熱飲料、亞硝胺、紅肉和微量營養(yǎng)素缺乏癥都與食管癌風險較高相關[14-15]。傳統(tǒng)手術切除是早期食管癌患者的首選治療方法，但對于晚期食管癌患者，則采用化學療法或放射療法。其中放射療法顯著提高了食管癌的療效，然而嚴重的副作用限制了放射療法的應用，以及在治療期間經(jīng)常發(fā)生放射抵抗性，使得患者無法獲得理想的臨床療效[3]。因此探索改善食管癌放療抵抗性的分子靶點對提高患者預后具有重要意義。

EVI1基因座最初在小鼠研究中被強調(diào)為位于引起髓樣腫瘤的常見逆轉錄病毒整合基因組位置，其與名為MECOM的MDS1形成融合基因，是正常發(fā)育過程中必不可少的核轉錄因子[16]。EVI1的過表達和激活已被證明可導致基因組不穩(wěn)定和血液系統(tǒng)相關腫瘤的發(fā)生[4-6]。EVI1是腫瘤治療的潛在分子靶點，但是其在食管癌中的表達及其作用未知。為了研究EVI1是否與食管癌放射抵抗相關，本研究采用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)EVI1在食管癌中的表達與患者分化程度、臨床分期和放療敏感性相關，在食管癌分化程度低、臨床分期晚期和放療抵抗的組織中EVI1的表達相對較高，表明EVI1高表達參與食管癌的惡性進展。與肝門膽管癌組織樣品中EVI1表達上調(diào)與腫瘤的組織學等級和腫瘤大小相關的研究具有一致性[17]。進一步采用spearman等級相關性分析EVI1的表達與食管癌放療敏感性的相關性，結果顯示EVI1在食管癌中的表達與患者放療敏感性呈負相關，提示EVI1可能參與食管癌的放療抵抗性。

為了進一步研究EVI1在食管癌放療抵抗中的作用，本研究采用分次放療遞增法誘導食管癌放療抵抗細胞株ECA109R，并采用MTS對其抵抗性進行了檢測，結果顯示在相同放射劑量下，食管癌放射敏感細胞ECA109的細胞存活率低于ECA109R細胞，并且ECA109細胞的放射IC50劑量值低于ECA109R細胞的放射IC50劑量值，表明ECA109R細胞成功誘導。并且western blotting檢測發(fā)現(xiàn)EVI1在ECA109R細胞中的表達高于在ECA109細胞中的表達，與其在組織水平中的表達具有一致性。采用siRNA轉染ECA109R細胞研究干擾EVI1的表達對食管癌細胞放療敏感性的影響，結果顯示與對照si-NC組相比，在相同放射劑量下，si-EVI1組ECA109R的放射IC50劑量值較低。且干擾EVI1的表達后，ECA109R細胞的克隆形成率降低，細胞凋亡率增加，表明EVI1促進食管癌細胞的放射抵抗，與Lu等[10]的研究報道一致。EVI1在食管癌放射抵抗中發(fā)揮作用的分子機制仍需進一步研究，細胞凋亡是放射殺傷腫瘤細胞抑制腫瘤惡性進展的重要作用機制[18]。而活化caspase 3蛋白是細胞發(fā)生凋亡的不可逆性標志，發(fā)揮促凋亡作用[19]。Bcl-2家族是調(diào)控細胞凋亡途徑的另一重要凋亡蛋白，參與放射抑制腫瘤細胞存活的生物過程[20-21]。本研究采用western blotting檢測發(fā)現(xiàn)干擾EVI1的表達后，ECA109R細胞中促凋亡蛋白活化caspase 3和Bax蛋白的表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達降低。表明EVI1通過調(diào)控凋亡相關蛋白促進食管癌細胞的放射抵抗作用。

4 結論

EVI1在食管癌放射抵抗組織中表達增加，與食管癌患者放射治療敏感性呈負相關，干擾EVI1的表達通過調(diào)控凋亡相關蛋白可增加食管癌細胞的放射敏感性。