曾順 熊悅 買文菊 雷關芝 佘光鵬 劉華 買文麗

(1.川北醫(yī)學院2014級臨床本科，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學院2016級臨床本科，四川 南充 637000；3.西昌市南寧中心衛(wèi)生院，四川 西昌 615000；4.川北醫(yī)學院2017級麻醉本科，四川 南充 637000；5.川北醫(yī)學院生理教研室，四川 南充 637000；6.川北醫(yī)學院機能中心，四川 南充 637000)

國際糖尿病聯(lián)盟公布，到2017年全球糖尿病患者已達到4.25億，我國糖尿病患者高達1.14億，為全球之首[1-2]。因此，理想糖尿病動物模型的建立對于疾病的研究意義重大。目前常用高糖高脂飲食配合注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)建立糖尿病動物模型[3-4]，該模型具備操作簡單、成模周期短、比基因鼠價格更低等優(yōu)點，但該方法不足之處是實驗動物狀態(tài)和藥物劑量會對成模動物肝腎功能和凝血系統(tǒng)造成嚴重影響，從而降低模型動物的生存率[5]。本實驗通過對年齡和藥物劑量間的相關性進行研究，探討最佳造模方式，為糖尿病大鼠高效造模提供可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級4周齡雄性健康SD大鼠100只，由川北醫(yī)學院實驗動物中心提供，體質(zhì)量(120±20) g。動物實驗遵守國際實驗動物倫理學要求。動物合格證號SYXK(川)2018-0761。

1.1.2 藥品與試劑 鏈脲佐菌素(solarbio公司，批號：615F031)；血糖試紙(三諾有限公司，批號：3825NS)。天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(AKP)、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)，以上檢測試劑盒批號均為20180710，均購自南京建成生物研究所。

1.1.3 儀器 三諾血糖儀，MB-530酶標儀(匯松科創(chuàng)有限公司)，離心機，低溫冰箱

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型的建立 動物隨機分為飼養(yǎng)4周對照組、4周低劑量組、4周高劑量組、8周對照組、8周低劑量組、8周高劑量組。4周和8周對照組大鼠分別為10只，其余造模組大鼠每組各20只。模型組給予高脂高糖飼料(D12492購自Research Diets公司)喂養(yǎng)4周和8周后造模。檸檬酸2.1 g加入雙蒸水100 mL中配成A液。檸檬酸鈉2.94 g加入雙蒸水100 mL配成B液，將A、B液按1∶1比例混合調(diào)節(jié)pH 4.2～4.5的檸檬酸緩沖液。注射時以0.1%的檸檬酸緩沖液配置注射所需STZ濃度。每個年齡段的STZ分兩個劑量：1%的STZ25 mg/kg和40 mg/kg進行腹腔注射，對照組腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。注射STZ后2 d、6 d鼠尾取血測空腹血糖(FBG)，若2次空腹血糖均≥11.1 mmol/L，認為造模成功。

1.2.2 標本收集與處理 造模后第6天，大鼠稱重，異氟醚吸入麻醉后，內(nèi)眥取血1 mL，測空腹血糖，剩余血液0～4 ℃靜置1 h，3500 r·min-1離心5 min，取上清液置于-80 ℃以備用，根據(jù)試劑盒說明書操作檢測AKP、ALT、AST、CRE、BUN、APTT、PT。

2 結果

2.1 各組動物模型建立結果比較 4周高劑量組造模第6天死亡率高達80%;8周低劑量組造模第6天死亡率0%，成模率85%；8周低劑量組死亡率最低，各組死亡率差異性顯著(P<0.001)；各組成模率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 造模6天各組大鼠死亡率及成模率比較[n(×10-2)]

2.2 各組大鼠血清AKP、ALT、AST活力變化 與對照組比較，4周造模組和8周高劑量組AKP差異顯著(P<0.05)；模型組間比較，8周低劑量組與其他造模組間存在顯著性差異(P<0.05)。4周和8周造模組ALT和AST均與其對照組有顯著性差異(P<0.05)，8周低劑量組與其他造模組間存在顯著性差異(P<0.05)。見圖1。

圖1 造模后6天各組大鼠血清AKP、ALT、AST值比較

2.3 各組大鼠血清CRE、BUN活力變化 與其對照組比較，4周造模組和8周高劑量組CRE均表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)；模型組間比較，8周低劑量組CRE與其他造模組間均存在顯著性差異(P<0.05)。4周造模組BUN均與4周對照組有顯著性差異(P<0.05)，8周造模組與8周對照組BUN比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。8周低劑量組BUN與4周低、高劑量組均有顯著性差異(P<0.05)。見圖2。

圖2 造模后6天各組大鼠血清CRE和BUN值比較

2.4 大鼠血清APTT、PT的變化 4周造模組APTT與其對照組均有顯著性差異(P<0.05)；8周低劑量APTT與其對照組無顯著性差異(P>0.05)，8周高劑量組與其對照組有顯著性差異(P<0.05)；8周低劑量組APTT與其他造模組間存在顯著性差異(P<0.05)。造模組PT雖有升高，但僅4周高劑量組與4周對照組有顯著性差異(P<0.05)。見圖3。

3 討論

近年中國糖尿病患病率急劇增加，已成為全球糖尿病患者人數(shù)最多的國家之一[6]。因此對糖尿病的研究尤為迫切，而理想糖尿病模型是研究的前提。目前，糖尿病模型的制備主要有試劑、手術和基因動物。試劑復制模型方法簡單便宜，故目前國內(nèi)建立動物模型主要方法還是以化學藥物注射誘導為主，其中一次性注射大劑量STZ進行造模，是目前普遍選用的方法[7]。STZ是一種DNA烷基化試劑(氨基葡萄糖-亞硝基脲)，其對胰腺β細胞有高選擇的毒性作用，獨立通過GLUT2葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT2 glucose transport protein)進入胰腺β細胞[8]，破壞β細胞，減少胰島素釋放，故作為復制糖尿病模型常用的試劑[9]。通常單次大劑量注射STZ可引起胰島β細胞的廣泛破壞，造成1型糖尿病模型；而多次小劑量注射STZ聯(lián)合高脂喂養(yǎng)，則可導致部分β細胞損傷和外周胰島素抵抗，從而造成2型糖尿病模型。大劑量注射導致胰島β細胞大量死亡，使血糖迅速升高，造模成功率高，但是該方法易造成動物酮癥酸中毒死亡[10-11]。小劑量多次腹腔注射STZ，雖可使血糖水平逐步上升，但造模時間長，模型穩(wěn)定性差，不利于慢性實驗開展。因此，本研究將實驗動物年齡和一次性注射STZ劑量的相關性進行比較，探討高效穩(wěn)定的復制2型糖尿病模型的方法。此外，研究顯示雄性動物的糖尿病成模率明顯高于雌性動物[12-13]。故本實驗均選用SD雄性大鼠，保證實驗的一致性，提高成模率。

圖3 造模后6天各組大鼠血清APTT和PT值

血糖結果顯示一次性腹腔注射STZ后4周高、低劑量組和8周高、低劑量組均造模成功，且成模率四組差異無統(tǒng)計學意義，這表明兩個年齡段和兩種劑量均能復制2型糖尿病模型。但4周高劑量組大鼠造模6天存活率僅20%，這樣的成活率完全不能滿足實驗要求。而8周低劑量組大鼠成模率85%，存活率100%，能形成穩(wěn)定的實驗模型。實驗發(fā)現(xiàn)4周高、低劑量組、8周高劑量組有多只大鼠在注射STZ后第2天開始出現(xiàn)眼睛和鼻腔出血，精神萎靡，迅速死亡，這與楊穎等[14]的研究結果相似。對大鼠血液生化進行分析，發(fā)現(xiàn)該三組大鼠APTT和PT明顯延長，APK、ALT、AST明顯升高，考慮高劑量組大鼠因藥物劑量過大，肝腎功能損傷嚴重，肝臟合成凝血酶能力下降，出現(xiàn)凝血功能障礙；而4周低劑量組出現(xiàn)相同癥狀考慮雖然低劑量但是大鼠年齡小，因此藥物也對肝腎造成嚴重損傷。同時該三組大鼠注射后，第2天多只大鼠血糖>33.3mmol/L,血酮>5mmol/L，出現(xiàn)酮癥酸中毒，故考慮大鼠死亡與酮癥酸中毒和肝腎嚴重損傷有關。喂養(yǎng)8周高劑量組肝腎損傷均低于喂養(yǎng)4周高劑量組，大鼠存活率也更高，表明相同劑量，年齡越大肝腎損傷越小，存活率越大[14]；4周高低劑量組和8周高低劑量組均顯示出相同年齡，劑量越小，肝腎損傷越小的傾向。

目前STZ造模劑量一般在25～70 mg/kg之間，且需要反復注射[15-16]。管志敏等[17]用STZ 20 mg/kg對8周齡大鼠多次腹腔注射復制模型。徐文平[18]用40、45、50 mg/kg STZ進行腹腔一次性注射造模，發(fā)現(xiàn)45 mg/kg組造模效果最好。與以上實驗相比，本實驗用低劑量25 mg/kg一次性注射成功復制2型糖尿病模型，減少對大鼠肝腎損傷，延長大鼠存活時間。本實驗發(fā)現(xiàn)鼠齡越大反而造模劑量越小，8周低劑量組成模率達85%，存活率達100%。這和劉歐飛等[19]結果一致。實驗結果顯示對SD大鼠8周高脂飼養(yǎng)后，腹腔一次性注射STZ 25 mg/kg能復制穩(wěn)定的2型糖尿病模型。

4 結論

4周齡大鼠進行高脂飼料喂養(yǎng)8周后，再進行STZ 25 mg/kg一次性腹腔注射，成模率和存活率均高，并且操作簡單，無需反復注射，形成穩(wěn)定的2型糖尿病模型。本研究結果為今后2型糖尿病治療與機制探討提供了良好的大鼠動物模型。