邢海艷，孫麗，吳旭，魯素雅，金鵬，金華

（淮安市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇淮安 223005)

防腐劑是指天然或合成的化學(xué)成分，用于加入食品、藥品、化妝品等以延遲微生物生長(zhǎng)或化學(xué)變化引起的產(chǎn)品腐敗，從而能夠長(zhǎng)久保持產(chǎn)品的安全性和穩(wěn)定性［1–3］?；瘖y品富含水分、油脂、蛋白質(zhì)、維生素、動(dòng)植物提取物等各種營(yíng)養(yǎng)活性物質(zhì)，為微生物的生長(zhǎng)提供了良好的條件，因此在化妝品中添加防腐劑是必不可少的。防腐劑的不當(dāng)使用是導(dǎo)致皮膚過(guò)敏和接觸性皮炎的第二大原因，僅次于香料［4–7］?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）中規(guī)定了多種許可防腐劑，但只收載了部分防腐劑的檢測(cè)方法［1，8］。4-羥基苯甲酸酯類化合物是化妝品中允許添加且經(jīng)常使用的防腐劑，但其中4-羥基苯甲酸異丙酯、4-羥基苯甲酸異丁酯、4-羥基苯甲酸戊酯、4-羥基苯甲酸苯酯、4-羥基苯甲酸芐酯是禁用防腐劑。4-羥基苯甲酸酯類化合物被報(bào)道具有雌激素樣作用，且4-羥基苯甲酸酯類化合物分子內(nèi)部的碳鍵越復(fù)雜，防腐能力越強(qiáng)，對(duì)皮膚刺激性也會(huì)越強(qiáng)，因此對(duì)化妝品中此類化合物的檢測(cè)具有重要意義［9–11］。

近年來(lái)，測(cè)定4-羥基苯甲酸酯類化合物的報(bào)道較多，主要有高效液相色譜法、液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法［12–16］?；瘖y品基質(zhì)比較復(fù)雜，質(zhì)譜法檢測(cè)時(shí)易污染儀器，且對(duì)提取方法要求較高。目前高效液相色譜法主要針對(duì)4-羥基苯甲酸甲酯、4-羥基苯甲酸乙酯、4-羥基苯甲酸丙酯、4-羥基苯甲酸丁酯等準(zhǔn)用防腐劑進(jìn)行檢測(cè)，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)收載了同時(shí)測(cè)定化妝品中7 種4-羥基苯甲酸酯的方法［17］，但采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定化妝品中9 種4-羥基苯甲酸酯類防腐劑尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者以甲醇溶解樣品，對(duì)樣品處理?xiàng)l件和色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上，建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定化妝品中9 種4-羥基苯甲酸酯類防腐劑的方法。該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度和靈敏度高，為化妝品中此類防腐劑的檢測(cè)與監(jiān)管提供新的思路和方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Waters 2695／2998 型，美國(guó)Waters 公司。

超聲清洗儀：KQ–250DV 型，昆山市超聲儀器有限公司。

超純水機(jī)：美國(guó)Millipore 公司。

有機(jī)系針筒式微孔濾膜：孔徑為0.45 μm，上海安譜公司。

電子天平：XP–6 型，感量為0.001 mg，瑞士梅特勒–托利多科技有限公司。

電子天平：XS205DU 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒–托利多科技有限公司。

磷酸：色譜純，上海麥克林試劑公司。

甲醇、乙腈：色譜純，德國(guó)默克公司。

4-羥基苯甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：基本信息見(jiàn)表1。

1.2 儀器工作條件

色譜柱：Waters Symmtery C18柱（2.1 mm×250 mm，5 μm，美國(guó)Waters 公司）；流動(dòng)相：A 相為0.1%磷酸溶液，B 相為乙腈，按表2 進(jìn)行梯度洗脫；流量：1.0 mL／min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3 溶液配制

分別稱取9 種4-羥基苯甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各25 mg，用甲醇溶解稀釋，配制成9 種防腐劑的質(zhì)量濃度均為0.5 mg／mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次移取0.002、0.004、0.02、0.05、0.1、0.2、0.4、2 mL 上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于8 只10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至標(biāo)線，配制成9 種防腐劑的質(zhì)量濃度均分別為0.1、0.2、1、2.5、5、10、20、100 μg／mL 的 系 列 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品處理

取化妝品樣品1.0 g，置于25 mL 具塞試管中，加入甲醇20 mL，超聲提取30 min，放置冷卻，加入甲醇稀釋至25 mL，靜置，過(guò)濾，取續(xù)濾液待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑選擇

參考《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015 年版）第四章中防腐劑檢測(cè)的提取溶劑［1］，比較了甲醇、體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇溶液、乙腈作為提取溶劑時(shí)的回收率，結(jié)果列于表3。由表3 可知，使用以上3 種溶劑提取時(shí)，樣品的回收率均大于70%。考慮到配制試劑需簡(jiǎn)便、低毒性，且甲醇極性大于乙腈，易提取，回收效果好，因此選擇甲醇作為提取溶劑。

表3 不同提取溶劑時(shí)的回收率（n=3） %

2.2 取樣量選擇

比較了取樣量為0.5、1.0、2.0 g 時(shí)樣品的回收率，結(jié)果列于表4。由表4 可知，不同取樣量時(shí)的回收率差異不明顯，故取樣量對(duì)樣品提取效率影響較小。為避免樣品量大時(shí)污染色譜系統(tǒng)，或取樣量不足導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果小于定量限等情況的發(fā)生，檢測(cè)時(shí)將取樣量定為1.0 g，如遇不同樣品時(shí)可適當(dāng)調(diào)整取樣量或稀釋樣品。

表4 不同取樣量時(shí)的回收率（n=6） %

2.3 提取時(shí)間選擇

選取含有4-羥基苯甲酸甲酯的陽(yáng)性樣品，以甲醇為溶劑，分別超聲5、10、15、20、25、30、45、60 min，測(cè)定并計(jì)算提取效率。試驗(yàn)結(jié)果表明，4-羥基苯甲酸甲酯極性較大，易溶于甲醇，超聲5 min 后即可完全提取，為確保其它8 種防腐劑提取完全，選擇超聲時(shí)間為30 min。

2.4 色譜條件選擇

《化妝品技術(shù)安全規(guī)范》（2015 年版）4.7 中分離12 種防腐劑采用的流動(dòng)相為0.05 mol／L 磷酸二氫鈉溶液–甲醇–乙腈（50∶35∶15），添加濃度為0.002 mol／L 的氯化十六烷三甲胺溶液，并用磷酸調(diào)節(jié)pH 至3.5。該流動(dòng)相配制復(fù)雜，各組分保留時(shí)間批間偏差較大。本實(shí)驗(yàn)選擇0.1%磷酸溶液–乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫。該流動(dòng)相體系配制簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性好，批間差異較小。對(duì)各組分進(jìn)行光譜分析，試驗(yàn)結(jié)果表明，最大吸收波長(zhǎng)在254 nm 附近，故檢測(cè)波長(zhǎng)選擇254 nm。取1.3 中質(zhì)量濃度為20 μg／mL的9 種4-羥基苯甲酸酯類防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可知，9 種防腐劑分離良好。

圖1 20 μg／mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

2.5 線性方程、檢出限與定量限

在1.2 液相色譜條件下，對(duì)1.3 中的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以待測(cè)防腐劑的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性方程、相關(guān)系數(shù)。取2 份陰性樣品，各1.0 g，分別加入不同濃度的9 種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4 方法處理樣品，在1.2 儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定，以3 倍信噪比（S／N）時(shí)樣品中待測(cè)防腐劑含量為檢出限，以10 倍信噪比（S／N）時(shí)待測(cè)防腐劑含量為定量限。9 種防腐劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限表5。

表5 9 種防腐劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.6 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

分別取粉質(zhì)基質(zhì)、水質(zhì)基質(zhì)陰性樣品各1.0 g，分別加入1.25、2.5、12.5 mL 質(zhì)量濃度為0.5 mg／mL 的9 種4-羥基苯甲酸酯類防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4方法處理樣品，制備成9 種4-羥基苯甲酸酯類防腐劑的質(zhì)量濃度均分別為25、50、250 μg／mL 的加標(biāo)樣品溶液，每個(gè)濃度點(diǎn)平行制備6 份，在1.2 液相色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6 可知，粉質(zhì)類樣品中各組分的平均回收率為97.69～104.06%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.92%～4.80%，水基質(zhì)類

樣品中各組分的平均回收率為95.73%～103.36%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.58%～5.28%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表6 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.7 實(shí)際樣品分析

對(duì)市售的15 批化妝品進(jìn)行測(cè)定，代表性的精華露樣品色譜圖如圖2 所示，由圖2 可知，化妝品中基質(zhì)未干擾目標(biāo)物的測(cè)定。15 批樣品的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表7。由表7 可知，化妝品中常用防腐劑為4-羥基苯甲酸甲酯、4-羥基苯甲酸乙酯和4-羥基苯甲酸丙酯，3 者的含量均未超過(guò)規(guī)定（4-羥基苯甲酸甲酯、4-羥基苯甲酸乙酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)均小于0.4%，4-羥基苯甲酸丙酯、4-羥基苯甲酸丁酯質(zhì)量分?jǐn)?shù)均小于0.14%，均按4-羥基苯甲酸甲酸計(jì)，總計(jì)不得超過(guò)0.8%。），未檢出禁用的5 種對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑。

圖2 精華露樣品色譜圖

表7 15 種市售化妝品中4-羥基苯甲酸酯類防腐劑含量檢測(cè)結(jié)果 μg／g

3 結(jié)語(yǔ)

建立了同時(shí)測(cè)定化妝品中9 種4-羥基苯甲酸酯類防腐劑的高效液相色譜法，以甲醇為溶劑，超聲提取，以C18色譜柱為分離柱，用二極管陣列檢測(cè)器分析。該方法提取簡(jiǎn)便，分離效果好，靈敏度高，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，可滿足此類防腐劑的檢測(cè)要求，為化妝品監(jiān)管和檢測(cè)提供新的方法。