嚴(yán)明，唐建，嚴(yán)寒，索德成

（1.廣西壯族自治區(qū)獸藥監(jiān)察所，南寧 530001; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081）

喹噁啉類抗生素是化學(xué)合成的具有喹噁啉-1，4-二氧化物母核結(jié)構(gòu)的化合物，主要包括卡巴氧、喹乙醇、喹烯酮、喹賽多和乙酰甲喹。四環(huán)素類抗生素是由放線菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，包括金霉素、土霉素、四環(huán)素及半合成衍生物甲烯土霉素、強(qiáng)力霉素等，其結(jié)構(gòu)中均含有并四苯基本骨架［1–2］。這兩類化合物均具有抗菌、促生長等作用，被廣泛用作豬、雞、魚等動(dòng)物的飼料添加劑［3–5］。近年來，抗生素的耐藥性和潛在危害成為關(guān)注的熱點(diǎn)［6–7］，按照《全國遏制動(dòng)物源細(xì)菌耐藥行動(dòng)計(jì)劃》部署，為維護(hù)我國動(dòng)物源性食品安全和公共衛(wèi)生安全，農(nóng)業(yè)部發(fā)布了中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194 號(hào)，決定停止生產(chǎn)、進(jìn)口、經(jīng)營、使用部分藥物飼料添加劑，自2020 年7 月1 日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有包括喹噁啉類和四環(huán)素類抗生素在內(nèi)的促生長類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料［8–9］。為了有效監(jiān)管飼料中喹噁啉類和四環(huán)素類抗生素的非法使用，建立飼料中喹噁啉類和四環(huán)素類抗生素的檢測方法十分必要。

目前飼料中喹噁啉類和四環(huán)素類抗生素的測定方法主要有高效液相色譜法［10–22］、液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法［23–29］，涉及的樣品主要以動(dòng)物組織和環(huán)境樣品為主［16–28］。高效液相色譜法檢測靈敏度低，并且無法作為確證檢測技術(shù)［29］。液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用法主要用于單獨(dú)測定喹噁啉類或四環(huán)素類抗生素［23–28］，并且操作復(fù)雜，檢測靈敏度和回收率較低，無法實(shí)現(xiàn)飼料中喹噁啉類和四環(huán)素類抗生素的同時(shí)測定。筆者通過對提取溶劑、凈化等前處理?xiàng)l件及儀器工作條件的優(yōu)化，建立了高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定飼料中卡巴氧、喹乙醇、喹烯酮、喹賽多、乙酰甲喹5 種喹噁啉類抗生素和金霉素、土霉素、四環(huán)素、甲烯土霉素、強(qiáng)力霉素5 種四環(huán)素類抗生素的方法。該方法準(zhǔn)確、可靠，靈敏度高，適用于飼料中喹噁啉類和四環(huán)素類抗生素的確證監(jiān)測和定量分析，可為飼料安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜儀：Waters TQS 型，配有電噴霧電離源(ESI 源)，美國沃特世公司。

固相萃取柱：Estela HLB SPE 柱，60 mg／3 mL，大連沈源檢驗(yàn)檢測咨詢有限公司。

電子天平：XY500–2c 型，感量為0.01 g，天津市精拓儀器科技有限公司。

分析天平：XSR204／AC 型，感量為0.1 mg，梅特勒–托利多國際有限公司。

氮?dú)獍l(fā)生器：Genius XE 35 型，畢克氣體儀器貿(mào)易（上海）有限公司。

尼龍濾膜：0.22 μm，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

氮?dú)猓后w積分?jǐn)?shù)大于99.99%，由Genius XE 35型氮?dú)獍l(fā)生器制備。

甲酸：質(zhì)譜純，美國希格瑪公司。

乙腈、甲醇：均為色譜純，美國賽默飛世爾科技有限公司。

其它試劑均為分析純，北京化學(xué)試劑公司。

10 種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品：基本信息見表1。

表1 10 種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品基本信息

實(shí)驗(yàn)用水為超純水，電阻率大于18 MΩ·cm，由Mili-Q 超純水系統(tǒng)純化制得。

配合飼料與濃縮飼料樣品：南寧大北農(nóng)飼料科技有限責(zé)任公司。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 液相色譜

色譜柱：Waters BEH C18柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm，美國沃特世公司）；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）–乙腈（B），流量為0.3 mL／min；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：0.0～2.0 min 時(shí)，流動(dòng)相A 為90%，2～3.5 min 時(shí)，流動(dòng)相A 從90%逐步降至75%，3.5～6.0 min 時(shí)，流動(dòng)相A 從75%逐步降至20%，保持1.0 min，7.1 min時(shí)，流動(dòng)相A 為90%，保持0.9 min。

1.2.2 質(zhì)譜

離子源：電子噴霧，正離子檢測（ESI+）；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；噴霧電壓：3 200 V；毛細(xì)管溫度：350 ℃；脫溶劑氣和碰撞氣：高純氮?dú)?，使用前調(diào)節(jié)各氣體流量使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測要求；數(shù)據(jù)采集方式：分段采集；10 種抗生素的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

1.3 樣品處理

稱取5 g（精確至0.01 g）飼料樣品，加入McIlvaine-Na2EDTA 緩沖液（MC 溶液）–乙腈(體積比為4∶6）混合溶液20 mL，超聲提取30 min，以10 000 r／min 轉(zhuǎn)速離心5 min。取5 mL 上清液，于40 ℃下氮?dú)獯抵? mL 左右，加入2 mL 磷酸二氫鈉緩沖溶液，漩渦混勻，備用。

表2 10 種抗生素的質(zhì)譜參數(shù)

HLB 固相萃取柱依次用3 mL 甲醇、3 mL 水活化，準(zhǔn)確移取3 mL 備用液過柱，用3 mL 水、3 mL 1%甲酸溶液依次淋洗，抽干。用3 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液，于40 ℃下氮?dú)獯抵两伞?zhǔn)確加入1 mL 甲醇–0.1%甲酸溶液（體積比為1∶9）溶解殘余物，混勻后過0.22 μm 尼龍濾膜，待測。檢測過程中注意避光操作。

1.4 溶液配制

檸檬酸溶液：0.1 mol／L，稱取21.01 g 檸檬酸，用水溶解并稀釋至1 000 mL。

磷酸氫二鈉溶液：0.2 mol／L，稱取71.63 g 磷酸氫二鈉，用水溶解并稀釋至1 000 mL。

鹽酸溶液：1 mol／L，移取9 mL 鹽酸，用水稀釋至100 mL。

氫氧化鈉溶液：1 mol／L，稱取4 g 氫氧化鈉，用水溶解并稀釋至100 mL。

MC 溶液：取檸檬酸溶液1 000 mL、磷酸氫二鈉溶液625 mL，混合均勻，用鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至4.0±0.05。加入60.5 g 乙二胺四乙酸二鈉，溶解，混合均勻。

MC 溶液–乙腈混合溶液（體積比為4∶6）：取MC 溶液400 mL、乙腈600 mL，混合均勻。

卡巴氧、喹乙醇、喹烯酮、喹賽多、乙酰甲喹混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：各組分質(zhì)量濃度均為1 mg／mL，準(zhǔn)確稱取卡巴氧、喹乙醇、喹烯酮、喹賽多、乙酰甲喹標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，置于10 mL 棕色容量瓶中，用2 mL 二甲基亞砜超聲溶解，加入甲醇定容至標(biāo)線，搖勻。

金霉素、土霉素、四環(huán)素、甲烯土霉素、強(qiáng)力霉素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：各組分質(zhì)量濃度均為1 mg／mL，準(zhǔn)確稱取金霉素、土霉素、四環(huán)素、甲烯土霉素、強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，置于10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至標(biāo)線，搖勻。

10 種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：每種抗生素的質(zhì)量濃度均為10 μg／mL，分別吸取100 μL 卡巴氧、喹乙醇、喹烯酮、喹賽多、乙酰甲喹混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和100 μL 金霉素、土霉素、四環(huán)素、甲烯土霉素、強(qiáng)力霉素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻。

10 種抗生素系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：依次吸取10 種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液5、10、20、50、100、200，500 μL，分別置于7 只10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇–0.1%甲酸溶液（1∶9）稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻，配制成10 種抗生素的質(zhì)量濃度均分別為5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200、500 μg／L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

10 種抗生素系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別取不同基質(zhì)的空白飼料樣品各7 份，按1.3 方法處理，吹干，分別加入1 mL 質(zhì)量濃度為5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200，500 μg／L 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制成10 種抗生素的質(zhì)量濃度均分別為5.0，10.0，20.0，50.0，100.0，200，500 μg／L 的 系 列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱選擇

分 別 考 察Waters BEH C18柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）、Waters HSS T3 C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）3 種C18色譜柱的分離效果。結(jié)果表明，Waters HSS T3 C18色譜柱分離效果較差，對喹噁啉類和四環(huán)素類抗生素保留較弱，飼料中部分雜質(zhì)對喹噁啉類和四環(huán)素類抗生素產(chǎn)生干擾，部分喹噁啉類和四環(huán)素類抗生素色譜峰形拖尾。Waters BEH C18色譜柱克服了大多數(shù)C18柱在低離子強(qiáng)度流動(dòng)相條件下因載量所導(dǎo)致的色譜峰形差的問題，有效改善了喹噁啉類和四環(huán)素類抗生素的色譜峰形。內(nèi)徑較大的Waters BEH C18柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）具有較高的理論塔板系數(shù)，相比Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）具有更好的分離效果，因此選擇Waters BEH C18柱（100 mm×3.0 mm，1.7 μm）。

2.2 流動(dòng)相選擇

分別考察了甲醇–0.1%甲酸溶液、乙腈–0.1%甲酸溶液2 種流動(dòng)相體系對喹噁啉類和四環(huán)素類抗生素的分離效果。結(jié)果表明，甲醇–0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相體系時(shí)，無法使甲烯土霉素、強(qiáng)力霉素達(dá)到滿意的分離效果；乙腈–0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，采用梯度洗脫，10 種喹噁啉類和四環(huán)素類抗生素能夠完全分離，且色譜峰形對稱。為了避免雜質(zhì)干擾，采取分段采集的方式，有效提高了方法靈敏度。以乙腈–0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，在1.2.1 梯度洗脫條件下，10 種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖如圖1 所示。

2.3 提取條件選擇

圖1 10 種抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

喹噁啉類和四環(huán)素類抗生素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)差異不大，提取劑選擇至關(guān)重要。根據(jù)文獻(xiàn)［13–16，20–24］，喹噁啉類抗生素常用的提取劑主要有甲醇、氯仿、乙酸乙酯和乙腈等單一或混合溶劑，四環(huán)素類抗生素常用MC 溶液與一定比例的乙腈或甲醇組成的混合溶液進(jìn)行提取。分別選擇甲醇、乙腈、二氯甲烷、MC 溶液、MC 溶液–乙腈混合溶液作為提取溶劑，考察不同溶劑對飼料中10 種喹噁啉類和四環(huán)素類抗生素的提取效果，結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可以看出，二氯甲烷和甲醇總體提取效果較差。乙腈對喹噁啉類抗生素提取效果較好，MC 溶液對四環(huán)素類抗生素提取效果好。MC 溶液–乙腈混合溶液對10 種待測物均具有較好的提取效果，以MC 溶液–乙腈（4∶6）混合溶液為提取溶劑，10 種待測抗生素的回收率均大于75%。故選擇MC 溶液–乙腈（4∶6）混合溶液為提取溶劑。

圖2 不同提取溶劑時(shí)10 種抗生素的回收率

2.4 固相萃取柱選擇

飼料成分復(fù)雜，部分雜質(zhì)會(huì)影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此需要對飼料提取液凈化處理。常用的凈化方法主要有液液萃取法和固相萃取法。固相萃取法試劑用量少，且凈化效果好。目前用于喹噁啉類藥物和四環(huán)素類藥物的固相萃取柱有HLB 柱、C18柱等。分別采用Waters Oasis HLB SPE 柱、Esela HLB SPE 柱和Aglinet C18SPE 柱對提取液進(jìn)行凈化，考察不同固相萃取柱的凈化效果，結(jié)果如圖3 所示。由圖3 可以看出，在1 000 μg／L 添加水平下，HLB 柱、C18柱對10 種抗生素均具有較好的保留。Esela HLB SPE 柱所裝的填料顆粒較大，樣品溶液更容易流過SPE 柱，操作更為簡單，而且批內(nèi)變異系數(shù)小，價(jià)格比Waters Oasis HLB SPE 柱更低，因此選擇Esela HLB SPE 柱作為凈化柱。

圖3 不同固相萃取柱凈化時(shí)10 種抗生素的回收率

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

不同飼料樣品的組成比較復(fù)雜，液相色譜–質(zhì)譜法分析時(shí)基質(zhì)干擾非常明顯。為了考察基質(zhì)效應(yīng)的影響，采用空白樣品加標(biāo)的色譜峰面積與溶劑加標(biāo)的色譜峰面積的比值，對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評估，以所得色譜峰面積的比值R表示基質(zhì)效應(yīng)。若R=1，說明無基質(zhì)效應(yīng)；若R＜1，呈基質(zhì)抑制效應(yīng)；若R＞1，呈基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。結(jié)果表明，飼料中10 種抗生素的R為0.779～0.868，存在明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)。為消除基質(zhì)效應(yīng)，獲得更準(zhǔn)確的定量結(jié)果，采取基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線校正法進(jìn)行定量分析。

2.6 線性方程、檢出限與定量限

按照1.2 儀器工作條件，分別對1.4 中的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，以待測抗生素的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以定量離子色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。以定量離子色譜峰的信噪比(S／N)大于3 所對應(yīng)的待測離子的質(zhì)量濃度作為方法檢出限，S／N大于10 所對應(yīng)的待測離子的質(zhì)量濃度作為定量限。10 種抗生素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表3。由表3 可知，10 種抗生素的質(zhì)量濃度在5.0～500 μg／L 范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.990～0.997，檢出限和定量限均滿足檢測要求。

2.7 加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)

精密稱取空白配合飼料與空白濃縮飼料樣品各5 g，分別加入適量的喹噁啉類和四環(huán)素類抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成10 種抗生素加標(biāo)質(zhì)量濃度均分別為50、100、1 000 ng／g 的加標(biāo)樣品溶液，每個(gè)添加水平平行制備5 份，在1.2 儀器工作條件下分別進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。由表4 可知，在高、中、低3 種加標(biāo)水平下，空白樣品加標(biāo)回收率為76.3%～99.9%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～11.4%。表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

表3 10 種抗生素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

表4 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語

通過對提取溶劑、凈化柱等前處理?xiàng)l件及HPLC–MS／MS 分析條件的優(yōu)化，建立了高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定飼料中10 種喹噁啉類和四環(huán)素類抗生素的方法。該方法操作簡單、分析速度快、準(zhǔn)確度和靈敏度高，適合于飼料中10 種喹噁啉類和四環(huán)素類抗生素的同時(shí)測定。