賀寶霞，陳金花，宋文憑，張文周

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院/河南省腫瘤醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450008)

維生素D水平與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系備受關(guān)注[1-2]。1α，25-二羥維生素D3[1α，25-dihydroxyvitamin D3，1α，25(OH)2D3]具有較強(qiáng)的抗腫瘤作用，不僅能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，還能誘導(dǎo)細(xì)胞分化與凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素P450 24A1(cytochrome P450 24A1，CYP24A1)是體內(nèi)活性維生素D進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶[3]。CYP24A1基因為候選致癌基因[4]。研究表明，CYP24A1基因多態(tài)性可以被作為判斷非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的指標(biāo)之一[5-6]。CYP24A1基因表達(dá)水平也可能成為評估肺腺癌和直腸癌預(yù)后的指標(biāo)[7-8]。CYP24A1存在基因多態(tài)性，并且這些多態(tài)性可能影響大腸癌的發(fā)生和預(yù)后[9]。本研究探討CYP24A1rs6068816(C>T)多態(tài)性與中國漢族女性乳腺癌易感性的關(guān)系，并通過meta分析評價rs6068816(C>T)多態(tài)性與乳腺癌的關(guān)系，旨在為有關(guān)中國漢族女性乳腺癌易感性的病因?qū)W研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 病例對照分析

1.1.1一般資料 收集2012年1月至2016年12月鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的674例中國漢族女性乳腺癌患者(病例組)和健康體檢中心672例健康體檢者(對照組)的全血標(biāo)本。本研究經(jīng)過鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(河南省腫瘤醫(yī)院)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)后進(jìn)行。所有受試者知曉研究內(nèi)容并簽署知情同意書。入選病例組的標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理診斷為乳腺癌的中國漢族女性患者。入選對照組的標(biāo)準(zhǔn)：與病例組年齡相匹配的健康女性，經(jīng)B超和鉬靶X線排除乳腺癌。病例組和對照組的排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、其他腫瘤、全身代謝疾病或其他嚴(yán)重疾??；(2)從事放射性照射職業(yè)；(3)主動或被動吸煙；(4)長期服用外源性雌激素。

1.1.2CYP24A1基因多態(tài)性檢測

1.1.2.1試劑與儀器 全人血液基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，北京天根生物公司；MgCl2、脫氧核糖核苷三磷酸(deoxynucleoside triphosphate，dNTP)和Hotstar Taq酶均購自Qiagen公司(德國)；質(zhì)譜儀、MassARRAY Nanodispenser RS1000點(diǎn)樣儀、Spectrochip芯片、MassARRAY RT軟件系統(tǒng)(版本號3.0.0.4)、MassARRAY Typer軟件系統(tǒng)(版本號3.4)，均購自Sequenom公司(美國圣地亞哥)；引物由上海英駿生物公司合成。

1.1.2.2檢測過程 采用試劑盒提取基因組DNA，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)檢測基因分型。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)：反應(yīng)體系5 μL，包括水1.9 μL，PCR緩沖液0.5 μL(含20 mmol·L-1MgCl2)，25 mmol·L-1MgCl20.4 μL，25 mmol·L-1dNTP 0.1 μL，Hotstar Taq酶0.1 μL，PCR引物1 μL和 DNA樣本1 μL；反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性15 min，94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共45個循環(huán)，最后72 ℃延伸3 min。堿性磷酸酶去磷酸化：人血清淀粉樣蛋白P(serum amyloid P，SAP)緩沖液0.17 μL，SAP酶0.3 μL和ddH2O 1.53 μL；反應(yīng)程序為37 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min。單堿基延伸反應(yīng)：ddH2O 0.62 μL，iPLEX緩沖液0.2 μL，終止混合物0.2 μL，延伸引物0.94 μL，iPLEX酶0.04 μL和PCR純化產(chǎn)物7 μL；反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃ 5 s，52 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s，共40個循環(huán)，最后72 ℃延伸3 min。樹脂除鹽純化，SpectroCHIP芯片點(diǎn)樣。Mass Spectrometry檢測，使用Typer 4.0軟件分析完成基因分型。

1.1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。采用Pearson’sχ2檢驗進(jìn)行基因型頻率及等位基因頻率比較和Hardy-Weinberg平衡分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 meta分析

1.2.1文獻(xiàn)檢索 以“乳腺癌”“基因多態(tài)性”“CYP24A1”和“rs6068816”為關(guān)鍵詞檢索中文數(shù)據(jù)庫包括中國知網(wǎng)、維普和萬方數(shù)據(jù)庫；以“breast cancer”“breast carcinoma”“genetic polymorphisms”“gene polymorphism”“CYP24A1”“rs6068816”為檢索詞檢索PubMed、Cochrane Library、EMBASE等外文文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫，時間截止至2020年6月30日。

1.2.2文獻(xiàn)納入和排除標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①有關(guān)CYP24A1rs6068816多態(tài)性和乳腺癌易感性關(guān)系的病例對照研究；②研究樣本量明確，有相應(yīng)基因型的頻數(shù)分布或優(yōu)勢比(odds ratio，OR)值，或根據(jù)提供的數(shù)據(jù)能夠計算出頻數(shù)分布的文獻(xiàn)。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①非多態(tài)性研究的文獻(xiàn)；②非rs6068816位點(diǎn)與乳腺癌易感性關(guān)系的研究。

1.2.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用RevMan 5.3軟件進(jìn)行meta分析。采用χ2檢驗分析納入文獻(xiàn)的異質(zhì)性。若各研究間不存在異質(zhì)性(I2≤50%)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行統(tǒng)計分析；若各研究間存在異質(zhì)性(I2>50%)，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行統(tǒng)計分析。利用Begg’s檢驗繪制漏斗圖，根據(jù)漏斗圖的對稱性來檢測所納入文獻(xiàn)是否存在發(fā)表偏倚。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例對照研究

2.1.1一般資料 兩組年齡、體質(zhì)量指數(shù)、絕經(jīng)率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 病例組和對照組基本情況比較

2.1.2CYP24A1rs6068816多態(tài)性與乳腺癌的易感性關(guān)系CYP24A1rs6068816 CC、CT和TT基因型在病例組的分布頻率分別為40.1%(270/674)、52.5%(354/674)和7.4%(50/674)，在對照組的分布頻率分別為 37.5%(252/672)、51.9%(349/672)和10.6%(71/672)。病例組和對照組CYP24A1rs6068816位點(diǎn)基因型分布(CC+CT與TT)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.074，P=0.046)。

2.2 meta分析

2.2.1文獻(xiàn)概況 共收集到相關(guān)文獻(xiàn)4篇，最終納入已發(fā)表文獻(xiàn)2篇[10-11]，合并本研究上述結(jié)果后進(jìn)行meta分析。meta分析中正常對照組3 094例，乳腺癌組2 355例。納入meta分析文獻(xiàn)的一般資料見表2。

表2 納入meta分析文獻(xiàn)的基本特征(n)

2.2.2meta分析結(jié)果 已納入文獻(xiàn)不存在異質(zhì)性(P>0.05)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行分析。T等位基因相對于C等位基因是乳腺癌的保護(hù)因素(P<0.05)，見圖1。突變純合型TT與野生純合型CC比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。顯性遺傳模型TT與CC+CT基因型比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。已納入文獻(xiàn)不存在發(fā)表偏倚。

圖1 CYP24A1 rs6068816與乳腺癌易感性的meta分析(T等位基因與C等位基因)

圖2 CYP24A1 rs6068816與乳腺癌易感性的meta分析(TT基因型與CC基因型)

圖3 CYP24A1 rs6068816與乳腺癌易感性的meta分析(TT基因型與CC+CT基因型)

3 討論

CYP24A1屬于細(xì)胞色素P450超家族成員，主要作用是催化25-羥基維生素D3和1，25-二羥基維生素D代謝為24-羥基化產(chǎn)物，導(dǎo)致維生素D失活[3]。CYP24A1在腎臟和胃腸道黏膜表達(dá)量較高。CYP24A1抑制劑能夠增強(qiáng)1α,25(OH)2D3的抗腫瘤細(xì)胞增殖作用。

近年來，多個研究報道CYP24A1遺傳多態(tài)性與多種腫瘤的易感性關(guān)系，如肺癌、乳腺癌以及結(jié)直腸癌等[9-12]。有研究表明CYP24A1mRNA的表達(dá)水平與乳腺癌有關(guān)[13]。在乳腺發(fā)育和妊娠相關(guān)的乳腺發(fā)育中，CYP24A1起關(guān)鍵作用[14]。CYP24A1在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，可以減弱1，25(OH)2D3的抗腫瘤活性，這可能是CYP24A1影響腫瘤發(fā)生的機(jī)制之一[15]。Sadeghi等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CYP24A1rs4809960 CC基因型能夠降低結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險。CYP24A1rs6068816 T等位基因攜帶者患肺癌的風(fēng)險相對較低[16]。CYP24A1rs2762934、CYP24A1rs6068816與肺癌發(fā)病風(fēng)險有較強(qiáng)的相關(guān)性[12]。有關(guān)CYP24A1rs2585428(G>A)、rs4809960(T>C)、rs6022999(A>G)和rs6068816(C>T)的研究結(jié)果顯示，ATGC單倍型大腸癌的發(fā)病風(fēng)險顯著降低[17]。CYP24A1rs6068816的多態(tài)性與中國人群胃癌易感性有關(guān)[18]。由本研究結(jié)果可知，rs6068816(C>T)突變可能會影響CYP24A1的活性，導(dǎo)致體內(nèi)活性1，25(OH)2D3水平改變，抗腫瘤作用減弱，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生。CYP24A1多態(tài)性在不同人群中的分布和遺傳特征不同。本研究與Reimers等[10]研究結(jié)果一致，與Clendenan等[11]研究結(jié)果相反。

本研究對rs6068816多態(tài)性與乳腺癌的易感性進(jìn)行了meta分析，結(jié)果依然顯示rs6068816 TT等位基因為乳腺癌的保護(hù)因素。有關(guān)rs6068816多態(tài)性與乳腺癌的文獻(xiàn)較少，meta分析僅納入檢索文獻(xiàn)2篇[10-11]及本研究中病例對照分析的數(shù)據(jù)。仍需擴(kuò)大樣本量并選取多個種族樣本進(jìn)一步證實CYP24A1rs6068816多態(tài)性與乳腺癌的易感性關(guān)系，并分析rs6068816多態(tài)性影響CYP24A1酶活性的機(jī)制，為乳腺癌的預(yù)防和治療提供參考依據(jù)。