張琦惠,胡 凱,梁 偉
(云南省玉溪市食品藥品檢驗所 云南 玉溪 653100)
維生素B2,也可被稱為維他命B2、核黃素等,其是人體多種輔酶的重要構(gòu)成部分。維生素B2 的質(zhì)量標準收載從2015 年版《中國藥典》到2020 年版《中國藥典》[1],未進行維生素B2 含量均勻度檢測,為了提高了制劑的均勻性要求。鑒于維生素B2 的應用相對廣泛,當前對其涉及含量測定的研究比較多,但少見有關維生素B2 含量均勻度的檢測方法,因而開展此次研究,以探究高效液相色譜法測定維生素B2 含量均勻度的效果,提高用藥安全。
Agilent1200 型高效液相色譜儀,配置二極管陣列檢測器(美國安捷倫公司);PM200 電子天平(梅特勒托利多);TBˉ215D 電子天平(賽多利斯);ELGA 超純水儀;優(yōu)普超純水儀,HUI10260F 超聲波清洗儀(天津恒奧科技發(fā)展有限公司)。
乙腈、甲醇、庚烷磺酸鈉都是色譜純,冰醋酸是分析純,水為蒸餾水,維生素B2 對照品(純度:98.2%,批號:100369 ~201504)由中國食品藥品檢定研究院提供;維生素B2 片(昆藥集團股份有限公司,批號:170415 ~01;華中藥業(yè)股份有限公司,批號:20171116;20170605,規(guī)格:5 mg)。量瓶中,加入鹽酸溶液(1 →2)10 mL,振搖,加適量蒸餾水,采用HUI10260F 超聲波清洗儀對其進行超聲震蕩,以使維生素B2 溶解,室溫下放冷,用蒸餾水稀釋至刻度,搖勻,作為儲備液(濃度為200μg/mL)。
2.2.2 供試品溶液制備的避光操作 選取含有維生素B2 的藥品10 片,分別將其置入50 mL 容量瓶中,加入鹽酸溶液(1 →2)10 mL,振搖,加適量蒸餾水,超聲震蕩,以使維生素B2 溶解,室溫下放冷,用蒸餾水稀釋至刻度,搖勻,濾過,精密量取濾過液5 mL,將其置入25 mL 容量瓶中,加蒸餾水稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。
2.3.1 標準曲線繪制 采用移液器,精密稱取維生素B2 的對照品儲備液1 mL、2 mL、5 mL、10 mL、20 mL 分別加入到100 mL 容量瓶中,用蒸餾水稀釋,將其制備成質(zhì)量濃度為2μg/mL、4μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL 的系列溶液,按擬定色譜條件進行測定,記錄色譜圖。以系列溶液濃度(C)為橫坐標,以色譜峰面積(A)為縱坐標繪制標準曲線,如下表1 和圖1。得回歸方程y=35.886xˉ4.6485(r=1.000)。結(jié)果表明,維生素B2 的質(zhì)量濃度在2 ~40μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好,見表1。
色譜柱為AgilentHCˉC18(4.6×150 mm,5μm),流動相為甲醇ˉ乙腈ˉ0.01 mol/L 庚烷磺酸鈉(0.5%冰醋酸溶液)按照5 ∶10 ∶85 比例設定,流速1.0 mL/min,檢測波長λ=444nm,進樣量20μl,柱溫30℃,理論塔板數(shù)按維生素B2 峰計高于2000,維生素B2 峰和其他雜質(zhì)峰分離度達到1.5。
2.2.1 對照品溶液制備避光操作 采用TBˉ215D 電子天平精密稱取維生素B2 的對照品10 mg,將其置入50 mL
2.3.2 精密度試驗 取維生素B2 的對照品儲備液適量,將其制備成維生素B2 的低質(zhì)量濃度(10μg/mL)、中質(zhì)量濃度(20μg/mL)、高質(zhì)量濃度(40μg/mL)的系列溶液,分別重復進樣六次,記錄色譜峰面積。三個不同濃度對照品溶液的RSD 值分別為0.63%、0.70%和1.28%(n=6),結(jié)果符合規(guī)定RSD<2.0%,表示隨機誤差小,儀器精密度較好,可用于維生素B2 質(zhì)量控制。
2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批號樣品(批號為20171116),參照“2.2”項下供試品溶液的制備方法制備溶液,分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h 時按照上述色譜條件進樣測定,記錄色譜峰面積。所得結(jié)果的RSD 為1.04%(n=6),結(jié)果表明供試品溶液穩(wěn)定性較好,在24 h 內(nèi)變化不明顯,可以達到檢測時間的要求。
2.3.4 重復性試驗 取同一批樣品(批號為20171116)6 份,參照“2.2”項下供試品溶液的制備方法制備溶液6 份,采用移液器,精密量取20μl 制備溶液,將其注入高效液相色譜儀,按上述色譜條件進行測定,記錄色譜圖峰面積。所得結(jié)果的RSD 為1.13%(n=6),結(jié)果表明供試品溶液的重復性較好,能夠滿足檢測要求。
取三個不同批號的樣品,參照“2.2”項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液,采用移液器,精密量取20μl 制備溶液,將其注入高效液相色譜儀,按上述色譜條件進行測定,記錄色譜圖峰面積并帶入回歸方程,計算百分含量,所得結(jié)果均滿足藥典要求,見表2。
表2 樣品含量均勻度的測定結(jié)果(n=6)
本文采取高效液相色譜法測定維生素B2 含量均勻度,實驗結(jié)果表明這種方法具有較強的專屬性與靈敏度,結(jié)果準確且可靠,可以用于維生素B2 含量均勻度測定。
維生素B2 是人體生命活動中不可或缺的重要組成部分,為體內(nèi)黃酶類輔基的組成部分(黃酶在生物氧化還原中發(fā)揮遞氫作用),當缺乏時,就影響機體的生物氧化,使代謝發(fā)生障礙[4]。維生素B2 在中性或酸性溶液中是比較穩(wěn)定的,其損失主要為以下方面:(1)可被光破壞;(2)在堿溶液中加熱可被破壞。由于體內(nèi)維生素B2 的儲存是很有限的,因此每天都要由飲食提供。準確檢測維生素B2 的含量,具有重要的臨床價值。
目前,維生素B2 的檢測方法多樣,在2020 年版《中國藥典》中,未進行含量均勻度測定,因維生素B2 影響因素多,易受輔料的干擾。但陳振欽的研究認為[5],采用紫外ˉ可見分光光度法測定維生素B2 片的含量均勻度是可行的,所建立的方法簡便且準確,檢測結(jié)果中,穩(wěn)定性和重復性都比較好,可將紫外ˉ可見分光光度法測定維生素B2 含量均勻度作為維生素B2 片的質(zhì)量控制標準。通過本次實驗,驗證了高效液相色譜法可用于測定維生素B2 含量均勻度檢測,該法檢測靈敏度高,是一種行之有效的方法。提示高效液相色譜法可用于維生素B2片質(zhì)量控制,且結(jié)果準確。黃偉志等研究也同樣認為,維生素B1、維生素B2 的質(zhì)量濃度分別在0 ~80μg/mL、0 ~40μg/mL 范圍內(nèi),與其峰面積呈線性關系,R2值分別為0.99998、0.99999,說明線性關系較好。檢測方法的精密度、相對標準偏差分別為0.50%、0.77%。結(jié)果得出檢測相對偏差分別在2%~5%、1%~5%,檢測結(jié)果與實測結(jié)果接近。提示高效液相色譜法可用,且結(jié)果準確。
有文獻提出,供試品溶液在避光條件下儲放保存,放置時間不會對測定帶來明顯影響。但是因為儲放中空氣的影響,讓測定結(jié)果不穩(wěn)定,有偏高的趨勢。同時,溫度對測定結(jié)果有較大的影響,所以在實驗當中,選擇密封性能良好的量瓶,并隨時密封好量瓶,實驗室溫度不能過低。
依照方法學驗證結(jié)果與含量均勻度測定結(jié)果可以得知,高效液相色譜法快速、簡便、準確度極高,相對偏差比較小,可以用于維生素制劑的質(zhì)量控制,確保藥品質(zhì)量,降低用藥風險。
綜上所述,高效液相色譜法具有操作方便、靈敏度高、準確、專屬性強的優(yōu)勢,可用于維生素B2 含量均勻度測定。