楚 戈，王 磊，李學(xué)斌，馬木提江·阿巴拜克熱，黃 佳

（1 新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)藥研究院<新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院>脊柱一科 新疆 烏魯木齊 830000）

（2 新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)藥研究院<新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院>骨四科 新疆 烏魯木齊 830000）

（3 新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院麻醉科 新疆 烏魯木齊 8300004）

（4 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附院肛腸科 新疆 烏魯木齊 830000）

（5 中南大學(xué)湘雅二院重癥監(jiān)護(hù)室 湖南 長沙 410000）

脊髓損傷（SCI）往往是由外傷引起的，導(dǎo)致各種癥狀，如疼痛，麻痹或運動失禁。治療包括抑制脊柱外傷和控制SCI 誘導(dǎo)的炎癥，防止進(jìn)一步的損害。SCI 的動物模型被廣泛應(yīng)用到脊髓損傷的病理病程及發(fā)病機制的研究中，在本課題的研究中，我們選取了一個方便，價格便宜，具有很強的可重復(fù)性脊髓壓迫SCI 小鼠模型[1]。成功制備小鼠脊髓損傷模型后，利用營養(yǎng)混合液（NM）處理小鼠，同時利用國際上已經(jīng)有過報道的BDNF 作為此實驗的陽性對照組[2]。營養(yǎng)混合液由賴氨酸、抗壞血酸、脯氨酸、綠茶提取物和其它微量營養(yǎng)素組成的，其具體成分為：700 mg 的維生素C、1000 mg的Lˉ賴氨酸、750mgLˉ脯氨酸、500 mg 的Lˉ精氨酸、200 mgNˉ乙酰半胱氨酸、1000 mg 標(biāo)準(zhǔn)化的綠茶提取物、30μg 硒、2 mg 銅和1 mg 錳。

1.資料與方法

1.1 脊髓損傷動物模型的構(gòu)建

手術(shù)前準(zhǔn)備的儀器與耗材：70%酒精，無菌棉簽和無菌拭子，手術(shù)刀和手術(shù)刀片，解剖牽引器及手術(shù)鑷子，微咬骨鉗（0.5×12 mm，F(xiàn)ine Science Tools，16221ˉ14）。1 mL 一次性注射器與26ˉG 腹腔麻醉注射針，微剪刀，兩種手術(shù)鑷子（5C,Dumont），血管夾（Kent Scientific Corporation,INS 14120,USA），6/0 單絲尼龍縫線和縫針，3 mL 一次性注射器。（1）使用Intraperitoneal ketamine and xylazine（10 mg/kg），將小鼠深度麻醉，并將其放置在熱墊上，固定并開始手術(shù)。（2）用手術(shù)刀沿著皮膚背部中線切開，使用微型手術(shù)剪刀將皮下組織從肌肉分離開。此處放入牽開器，以得到更好的手術(shù)視線。（3）利用手術(shù)刀并行切開椎旁淺部和深部肌肉直到椎骨，暴露脊柱T5ˉT8。（4）剝離T5ˉT8 節(jié)段椎體韌帶及周邊肌肉。（5）在手術(shù)顯微鏡下切除椎板。（6）利用動脈瘤夾在T6ˉT7 硬膜外壓縮1 min，使用過程中要注意夾的力度及嚴(yán)格控制時間，避免產(chǎn)生嚴(yán)重的急性壓迫損失，從而得到好的脊髓損傷模型。（7）除去夾子后，壓縮的部位處具有明顯出血環(huán)。（8）使用微型縫合針及6/0 縫合線進(jìn)行肌肉和皮膚雙層縫合。（9）手術(shù)后，切口處注射lml 含有慶大霉素生理鹽水，防止傷口感染，1 次/d，連續(xù)注射3 d。（10）術(shù)后的小鼠在術(shù)前環(huán)境中進(jìn)行單獨飼養(yǎng)，麻醉蘇醒后首次膀胱按摩輔助排尿，此后輔以每天兩次的按摩，直到10 日后膀胱反射恢復(fù)正常為止。（11）小鼠正常后轉(zhuǎn)入常規(guī)環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2 實驗分組

在小鼠脊髓損傷實驗中，自2017 年1 月起，取生長期為8 周的健康雄性CDˉ1 小鼠40 只，體重范圍22 ～28 g，隨機分為5 組，每組8 只：假手術(shù)組（sham surgery group, Sham）：僅切除椎板，不損傷暴露的脊髓。脊髓損傷生理鹽水組（saline group）：脊髓損傷小鼠模型造模成功后，傷后灌胃生理鹽水，3 次/d，持續(xù)1 周。脊髓損傷低濃度治療組（NM-LD group）：脊髓損傷小鼠模型造模成功后，傷后灌胃等體積的營養(yǎng)混合液（500μg），3 次/d，持續(xù)1 周。脊髓損傷高濃度治療組（NM-HD group）：脊髓損傷小鼠模型造模成功后，傷后灌胃等體積的營養(yǎng)混合液（2000 μg），3 次/d，持續(xù)1 周。BDNF 治療組（BDNF group）：脊髓損傷小鼠模型造模成功后，傷后灌胃等體積的稀釋過的BDNF，3 次/d，持續(xù)1 周。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察NM 對各組小鼠脊髓組織學(xué)變化。

1.4 脊髓組織HE 染色

獲取各實驗組小鼠，安樂死處理后，取脊髓組織，3.7%多聚甲醛固定，于70%、80%、95%、100%各種濃度乙醇逐級脫水，二甲苯透明，浸潤、包埋，切片。切片脫蠟，水洗，蘇木素染色5 min，水洗，70%酒精及1%鹽酸分化，1%氨水返藍(lán)，水洗，伊紅染色20 s，酒精脫水，二甲苯透明，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察脊髓組織病理改變。

2.結(jié)果

在假手術(shù)組中，脊髓HE 染色顯示正常，幾乎無毛細(xì)血管增生及炎性細(xì)胞的浸潤；在脊髓損傷生理鹽水組中，可以看到明顯的中央管內(nèi)出血，大量毛細(xì)血管增生，神經(jīng)元大量死亡，在NMˉLD 組、NMˉHD 組及BDNF 組中，相對于生理鹽水組，組織受損得到明顯的改善，見圖1。

圖1 脊髓損傷各組模型組織學(xué)改變

3.討論

脊髓損傷（SCI）造成很高的死亡率，導(dǎo)致嚴(yán)重殘疾，漫長的康復(fù)過程及昂貴的治療費用，對患者和社會產(chǎn)生嚴(yán)重的精神和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。SCI 的治療目前還沒有明確的方案。研究表明[3]，眾多的實驗?zāi)Ｐ驼龔亩喾矫娼忉尲敖鉀Q這個根本問題。脊髓挫傷是最常用于脊髓損傷動物模型，可以創(chuàng)建分級傷害和特異出血性壞死，局部缺血，炎癥等癥狀[4]。

原發(fā)性脊髓損傷為機械損傷，造成血管損壞或異常痙攣收縮，局部缺血，引起脊髓局部損傷及腫脹，造成進(jìn)一步的傷害。脊髓損傷病理學(xué)檢測表明，損傷后脊髓中央?yún)^(qū)可見明顯的進(jìn)行性出血，對局部毛細(xì)血管和小靜脈形成的微循環(huán)造成了嚴(yán)重?fù)p傷[5]。病程的發(fā)展中，出血可出現(xiàn)明顯的創(chuàng)傷后梗塞。同時，受損區(qū)域炎性細(xì)胞增加，釋放多種細(xì)胞因子，造成細(xì)胞生長微環(huán)境的改變，導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷或死亡[6]。從病理學(xué)和脊髓損傷的發(fā)展病程中發(fā)現(xiàn)，在對SCI 患者的治療中，需及時改善早期損傷節(jié)段的血液運輸，減少缺血對脊髓組織的影響，在損傷后期創(chuàng)造適宜的再生微環(huán)境，促進(jìn)脊髓損傷的及時修復(fù)[7ˉ8]。

SCI 的動物模型以及被廣泛應(yīng)用到脊髓損傷的病理病程及發(fā)病機制的研究中，用于了解SCI 病理生理變化以及對細(xì)胞損傷和脊髓的修復(fù)過程[9]。利用HE 染色檢測各組模型小鼠中的組織學(xué)改變，脊髓損傷模型構(gòu)建后出現(xiàn)明顯脊髓出血、腫脹、充血。HE 染色觀察，可見受損脊髓區(qū)域淋巴細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞增多，炎性細(xì)胞浸潤明顯，中央管內(nèi)出血，大量毛細(xì)血管增生。見部分神經(jīng)元固縮壞死，且可以觀察到空洞形成。如圖1 所示，在假手術(shù)組中，脊髓HE 染色顯示正常，幾乎無毛細(xì)血管增生及炎性細(xì)胞的浸潤。在脊髓損傷生理鹽水組中，可以看到明顯的中央管內(nèi)出血，大量毛細(xì)血管增生，且神經(jīng)元大量死亡，在NMˉLD 組和NMˉHD 組中，相對于生理鹽水組，組織受損得到明顯的改善，NMˉHD 組對脊髓組織損傷的改善程度和BDNF 組相似。綜上所述，NM 對脊髓損傷小鼠脊髓組織改善起積極作用。