申敬偉 董芳莉 楊海軍

安陽市腫瘤醫(yī)院病理中心，河南 455000

人表皮生長因子受體-2（HER-2）是定位于染色體17q12-21，32 上的原癌基因-人表皮生長因子受體2 基因（C-erbB-2 基因）編碼的相對分子質(zhì)量為185 000 的跨膜受體樣蛋白，具有酪氨酸激酶活性。該蛋白結(jié)構(gòu)分為3 個部分：胞外區(qū)域（ECD）、跨膜區(qū)域與胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域。正確檢測和評定乳腺癌和胃癌的HER-2 蛋白表達和基因擴增狀態(tài)對乳腺癌和胃癌的臨床治療及預(yù)后判讀至關(guān)重要［1-3］。目前對HER-2表達評估的金標(biāo)準(zhǔn)是組織學(xué)方法，即通過免疫組化（IHC）或熒光原位雜交（FISH）技術(shù)對患者的組織標(biāo)本進行檢測，免疫組化作為評價HER-2 蛋白狀態(tài)簡便且實用的方法被廣泛應(yīng)用。近年全自動免疫組化染色平臺的應(yīng)用在免疫組化染色的標(biāo)準(zhǔn)化控制中起重要作用［4］，但不同免疫組化染色平臺染色效果存在一定的差異。本實驗將HER-2 抗體在兩種不同免疫組化染色平臺結(jié)果不一致的原因分析報道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2019 年1—9 月本院病理科存檔的腫瘤標(biāo)本40例，其中浸潤型乳腺癌25例，胃腺癌15例。

1.2 儀器與試劑 美國Roche Ventana XT 全自動免疫組化儀；德國Leica Bond Max 全自動免疫組化儀；Leica RM2235型石蠟切片機；德國Leica 顯微鏡；HER-2抗體（4B5，工作液）為美國Roche公司產(chǎn)品；Roche封閉式二抗系統(tǒng)；Leica封閉式二抗系統(tǒng)。

1.3 方法 蠟塊連續(xù)3 μm切片2張，分別用貼置Roche、Leica標(biāo)簽的防脫載玻片撈片，添加陽性對照組織，70 ℃烤片50 min，羅氏標(biāo)簽的玻片牛奶浸泡15 min，分別上機全自動處理。Roche Ventana和Leica Bond全自動免疫組化染色平臺均使用Roche公司的HER-2抗體（4B5，工作液），同一批號，分別使用各自封閉的二抗系統(tǒng)。兩種染色平臺使用各自的標(biāo)準(zhǔn)化SOP操作流程。染色結(jié)果在顯微鏡下觀察對比。

1.4 判讀標(biāo)準(zhǔn) （1）乳腺癌HER-2免疫組化判讀參照我國乳腺癌HER-2 檢測指南（2019 版）［2］，0：陰性，無染色或≤10%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)不完整的、微弱的細(xì)胞膜染色；1+：陰性，＞10%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)不完整的、微弱的細(xì)胞膜染色；2+：不確定，＞10%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)弱到中等強度的、完整細(xì)胞膜染色或≤10%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)強而完整的細(xì)胞膜染色；3+：陽性，＞10%的浸潤癌細(xì)胞呈現(xiàn)強、完整、均勻的細(xì)胞膜染色。（2）胃癌HER-2 免疫組化判讀參照我國胃癌HER-2 檢測指南（2011 版）［5］，0：陰性，無反應(yīng)或＜10%腫瘤細(xì)胞膜染色；1+：陰性，≥10%腫瘤細(xì)胞微弱或隱約可見細(xì)胞膜染色；僅有部分細(xì)胞膜染色；2+：不確定，≥10%腫瘤細(xì)胞有弱到中度的基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性細(xì)胞膜染色；3+：陽性，≥10%腫瘤細(xì)胞基底側(cè)膜、側(cè)膜或完全性細(xì)胞膜強染色。

2 結(jié) 果

2.1 浸潤性乳腺癌HER-2 在兩種全自動免疫組化儀的染色結(jié)果 25 例浸潤性乳腺癌HER-2 在Roche Ventana XT 和Leica Bond Max 全自動免疫組化的染色結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），Kappa 值0.135，一致性較差，具體見表1及圖1～2。

表1 25例浸潤性乳腺癌HER-2在兩種全自動免疫組化儀的染色結(jié)果（n）

2.2 胃癌HER-2 在兩種全自動免疫組化儀的染色結(jié)果 15例胃癌HER-2在Roche Ventana XT和Leica Bond Max全自動免疫組化儀的染色結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），Kappa值0.186，一致性較差，具體見表2及圖3～4。

表2 15例胃癌HER-2在兩種全自動免疫組化儀的染色結(jié)果（n）

3 討 論

正確檢測和評定乳腺癌和胃癌的HER-2 蛋白表達和基因擴增狀態(tài)對乳腺癌和胃癌的臨床治療及預(yù)后判斷至關(guān)重要［3，6］，因此，HER-2 檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性非常重要。全自動免疫組化染色平臺在免疫組化技術(shù)中應(yīng)用廣泛，染色結(jié)果可靠，操作簡單，背景清晰，染色效果更佳［7］。本實驗室一直使用Roche Ventana XT 染色平臺進行HER-2（4B5）檢測，染色效果滿意。HER-2（4B5）抗體含有足夠50 次試驗的試劑，50 次用完后試劑瓶里還存有1 ml左右的試劑量，殘存的試劑在Leica Bond Max 染色平臺進行HER-2（4B5）檢測，未達到理想效果。本實驗室發(fā)現(xiàn)HER-2（4B5）在Roche Ventana XT 染色平臺效果優(yōu)于 Leica Bond Max，25 例浸潤性乳腺癌 HER-2 在 Roche Ventana XT和Leica Bond Max 全自動免疫組化儀的染色結(jié)果比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），Kappa值0.135，一致性較差；15例胃癌 HER-2 在 Roche Ventana XT 和 Leica Bond Max 全自動免疫組化儀的染色結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但是Kappa 值0.186，一致性較差。可能原因是樣本例數(shù)較少，有待后續(xù)實驗增加樣本例數(shù)進行驗證。

HER-2（4B5）抗體是一種兔單克隆抗體，與石蠟包埋的組織切片中的HER-2 相結(jié)合。使用可識別兔免疫球蛋白的生物素結(jié)合二抗，使用二抗HRP 結(jié)合物對特異性抗體進行定位。隨后通過酶反應(yīng)底物的沉淀使特異性抗體-酶復(fù)合物顯色。Roche 封閉式二抗系統(tǒng)即Ultra View Universal DAB Detection Kit 含有HRP 標(biāo)記的抗體混合物（山羊抗小鼠IgG，山羊抗小鼠IgM 和山羊抗兔）。Leica 封閉式二抗系統(tǒng)即Bond Polymer Refine Detection 含有抗兔多聚物HRP-IgG。 HER-2（4B5）工 作 液 和 Roche 二 抗 系 統(tǒng) 是Ventana XT 的封閉式一抗和二抗，兩者匹配運用于Roche Ventana XT 染色平臺，效果最優(yōu)。HER-2（4B5）工作液用于Leica Bond Max 染色平臺屬于開放型一抗，需要用Bond 一抗稀釋液稀釋到合適的濃度，才能結(jié)合Bond Polymer Refine Detection 達到最優(yōu)化的使用條件。本實驗直接使用HER-2（4B5）工作液用于Leica Bond Max 染色平臺，出現(xiàn)3+陽性例數(shù)增多和染色過深，可能和一抗的濃度有關(guān)。

決定免疫組化染色效果的重要因素是抗原修復(fù)，腫瘤標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定和石蠟包埋后，大量蛋白相互交聯(lián)，抗原修復(fù)打開交聯(lián)的蛋白，暴露抗原［8］。合適的修復(fù)液是影響抗原修復(fù)效果的重要因素，Roche Ventana XT 抗原修復(fù)液pH 8.0～8.5，Leica Bond Max 抗原修復(fù)液pH 9.0。本實驗HER-2（4B5）工作液用于Leica Bond Max 染色平臺2+和3+結(jié)果多于Roche Ventana XT 染色平臺，其中2 例染色比陽性對照組織染色深，非特異背景增加，可能與高pH值抗原修復(fù)液有關(guān)。在實際工作中，抗原有最合適的pH 值范圍。因為組織經(jīng)固定、包埋后抗原表面所帶電荷發(fā)生改變，從而影響抗原與抗體的結(jié)合，在一定pH 值修復(fù)液中進行修復(fù)，會恢復(fù)抗原表面原來的帶電荷狀態(tài)，達到最佳染色效果［9］。

圖1 Roche Ventana XT 染色平臺浸潤型乳腺癌2+（HER-2 ×20） 圖2 Leica Bond Max 染色平臺浸潤型乳腺癌3+（HER-2 ×20） 圖3 Roche Ventana XT 染色平臺胃癌2+（HER-2 ×20） 圖4 Leica Bond Max 染色平臺胃癌3+（HER-2 ×20）

決定免疫組化染色效果的另一重要因素是一抗的染色，兩種免疫組化染色平臺的技術(shù)原理不同，Roche Ventana XT 采用液體封蓋膜技術(shù)，防止試劑揮發(fā)，同時采用空氣渦流技術(shù)混勻試劑，一抗受到稀釋，達到最佳濃度。Leica Bond Max 采用Covertiles 技術(shù)，試劑側(cè)面微量泵抽吸，直接滴加在組織表面，抗原抗體結(jié)合，對于開放性一抗，如果沒有稀釋，濃度偏高，影響染色結(jié)果。

綜上所述，不同的免疫組化染色平臺的技術(shù)原理及配套的封閉試劑不同，其染色效果液存在一定差異。因此，為了提高病理切片質(zhì)量，推進規(guī)范化操作流程，針對不同的抗體選用合適的染色平臺。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。